据该项目组负责人、北京局检验检疫技术中心动物实验室博士高志强介绍，项目在实验过程中，共建立了3种检测方法。最终的禽流感病毒H7N9亚型双重荧光RT-PCR检测方法是在禽流感病毒H7亚型和N9亚型单重荧光RT-PCR检测方法的基础上通过优化建立，从而实现了对禽流感病毒H7N9亚型的一步快速定型。这种方法不仅能检测最近流行的H7N9毒株，还可以用于筛查其他H7亚型毒株。此方法不仅引物特异，而且探针特异，这一“双特异”性保证了结果的准确性，同时比普通PCR检测技术要灵敏100~1000倍。
荧光RT-PCR检测禽流感病毒原理
荧光ＲＴ－ＰＣＲ就是在聚合酶链式反应（ＰＣＲ）原有的一对特异性引物基础上增加了一条特异性荧光双标记探针。标准主要起草单位——北京出入境检验检疫局的科研人员根据Ａ型流感病毒的核酸保守区共有序列，开发设计上百对引物和几十条探针序列，从中筛选出了敏感、特异的引物、探针，建立快速的通用型一步法检测活禽或禽产品中所有Ａ型禽流感病毒及针对Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９亚型的荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测技术。
ＰＣＲ反应进行一个循环，在合成了Ｎ条新链的同时，就水解了Ｎ条探针，并释放出了相应数量的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与ＰＣＲ反应产物的量呈对应关系。随着ＰＣＲ反应的循环往复，ＰＣＲ产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。如果以每一个ＰＣＲ循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以ＰＣＲ循环数为横坐标作图，即可得到一条连接每一个循环后荧光值的扩增曲线。当检测标本中含有所要检测病原体的核酸序列时，所得到的曲线呈“Ｓ”型；而当标本中不含病原体，则ＰＣＲ过程不发生，探针不被水解，不产生荧光信号，其扩增曲线为一水平线。也就是说，扩增曲线为“Ｓ”型时，就检出了禽流感病毒；当扩增曲线为水平线时，就没有禽流感病毒检出。利用荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的４项标准有３项分别是对Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９亚型禽流感病毒检测提出的，还有一项是通用检测方法的标准。北京出入境检验检疫局动物检验检疫实验室主任张鹤晓介绍说，该方法可以检测Ｈ１～Ｈ１５的各种禽流感病毒。
禽流感病毒各亚型均属A型流感病毒，根据A型流感病毒共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针与禽流感病毒特有的共同基因特异性结合，结合部位位于引物结合区域内。探针的5’端和3’端分别标记不同的荧光素，如5’端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用R表示），3’端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团（用Q表示）。
当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5’→3’外切核酸酶的功能，将探针水解成单核苷酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收；在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和Q基团均游离于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。
荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测法特点
敏感性高、特异性强：荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测方法不仅能够用来检测禽流感病毒Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９亚型，对其他禽流感病毒亚型也能检出，而且用通用型探针、引物检测常见的其他禽类病毒，未发现交叉反应，这就说明该方法敏感性高、特异性强。
节约检测时间：在检验检疫实践中，如果用仅针对某一亚型禽流感病毒的探针、引物，一个亚型一个亚型的测试，势必会浪费人力、物力和时间。因此，先用通用型探针、引物验证是否是禽流感病毒，再用亚型的探针、引物分型，将大大节约检测时间。
不易污染：荧光ＲＴ－ＰＣＲ技术通过连接电脑分析ＰＣＲ过程中产生的荧光信号，实现了实时、在线检测ＰＣＲ扩增过程，而无需对ＰＣＲ扩增产物进行后处理，克服了传统的ＰＣＲ技术易污染的缺点，可实现在同一个标准的操作程序条件下进行稳定、可靠的检测。
