水是否符合饮用水的标准，除需对其感官质量、放射性物质、与健康有关的无机成分等进行分析测定外，还必须对微生物进行检测。细菌总数是水体被细菌污染程度的判定指标，细菌总数越多，说明水体受污染的程度越严重。如果水源被粪便污染,则有可能被肠道病原菌污染而引起伤寒、霍乱、大肠杆菌性脑膜炎、痢疾等肠道病的可能性很大。而大肠菌群是肠道细菌中最普遍和数量最多的一类细菌，所以常将其作为粪便污染的指示菌。细菌总数和大肠菌群数也是大多数食品微生物指标中的两项指标，只是数量要求随不同的食品而异。
本实验应用细菌学指标的检验方法来检测水及食品中的微生物学指标，从而确定水及食品是否符合卫生标准。
1 材料与方法
1.1材料
湖水、黄酒
1.2 培养基及试剂
肉膏蛋白胨琼脂培养基；乳糖胆盐发酵培养基；伊红美蓝固体培养基；乳糖发酵培养基，其它化学试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器
恒温培养箱；超净工作台；立式高压灭菌锅
1.4 细菌总数的测定
1.4.1采样
瓶装发酵酒的取样：用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌开瓶器将瓶启开，倒入500ml灭菌磨口瓶中，覆盖一灭菌纱布，轻轻震荡使气体逸出，待检。
湖水的取样：将无菌带玻璃塞的广口瓶浸入离湖面10-15cm水下，盛满后将瓶口盖好，再从水中取出，待检或保存于4℃冰箱保存。
1.4.2检样稀释
将1ml待测液加入含9ml无菌水的试管中，制成10-1稀释液，再吸取1ml稀释液加入到含含9ml无菌水的试管中，制成10-2稀释液，同法，配制稀释度为10-3、10-4、10-5的稀释液。
1.4.3倾注培养
选择10-4和10-5两个稀释液，分别取1ml于平皿内，及时倒入约45℃肉膏蛋白胨琼脂培养基约15ml，摇动混匀，待凝固后将平皿倒置于36±1℃的恒温箱内培养24±2h后取出，计算平板内菌落总数。
1.5 大肠菌群检验
1.5.1检样稀释
将1ml待测液加入含9ml无菌水的试管中，制成10-1稀释液，再吸取1ml稀释液加入到含含9ml无菌水的试管中，制成10-2稀释液。
1.5.2 乳胆盐发酵
分别取1、10-1、10-2稀释液1ml注入乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种3管，于36±1℃的恒温箱里倒置培养24±2h，如乳糖胆盐发酵管不产气则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。
1.5.3 分离培养
将产气的发酵管分别接种于伊红美蓝琼脂平板上，于36±1℃恒温箱倒置培养18-24h。观察菌落形态，做革兰氏染色和复发酵证实实验。
1.5.4 复发酵证实实验
在伊红美蓝琼脂平板上挑取：①紫红色，具有金属光泽的菌落；②深红色，不带或略带金属光泽的菌落；③淡红色，中心较深的菌落。具有以上特征的菌落均为可疑大肠杆群菌落，挑取1-2个进行革兰氏染色，同时对应接种到乳糖发酵管内进行复发酵，于36±1℃的恒温箱倒置培养24±2h，观察产气情况。凡在乳糖发酵管内产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性；如不产气或革兰氏阳性，则可报告大肠军群阴性。
2 结果与分析
2.1细菌总数的测定
取湖水、黄酒稀释度为10-4和10-5的稀释液于牛肉膏蛋白胨培养基内混合培养，每一稀释度2个平板 。结果如表1.1，表1.2所示。报告，湖水细菌总数为3.7×105个/ml，黄酒细菌总数＜1×104个/ml。
表1.1 湖水倾注培养结果
 稀释度 菌落数平皿号 |
10-4 |
10-5 |
备注 |
| 1 | 40 | 6 | |
| 2 | 34 | 8 | |
| 平均 | 37 | 7 |
表1.2 黄酒倾注培养结果
| 稀释度菌落数 平皿号 |
10-4 |
10-5 |
备注 |
| 1 | 0 | 0 | |
| 2 | 0 | 0 | |
| 平均 | 0 | 0 |
2.2 大肠菌群检验
2.2.1 乳糖胆盐发酵
分别取黄酒、湖水1、10-1、10-2稀释液1ml注入乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种3管，于36±1℃的恒温箱里倒置培养24±2h，结果如表2.1和表2.2所示。湖水接种量0.01ml只有1管产气其原因可能是乳糖胆盐发酵产酸使培养液变黄变浑浊，无法辨别杜氏小管中是否有气泡。也可能是100倍的稀释已经将产气菌稀释，故不见产气反应。应对该稀释度再次进行胆盐发酵实验，验证其是否产气，如不产气则可确定为大肠菌群阴性管。
表2.1 湖水乳糖胆盐发酵
| 接种量(ml) | 1号管 | 2号管 | 3号管 |
| 1 | 产气 | 产气 | 产气 |
| 0.1 | 产气 | 产气 | 产气 |
| 0.01 | 不产气 | 产气 | 不产气 |
表2.2 黄酒乳糖胆盐发酵
| 接种量(ml) | 1号管 | 2号管 | 3号管 |
| 1 | 不产气 | 不产气 | 不产气 |
| 0.1 | 产气 | 不产气 | 不产气 |
| 0.01 | 不产气 | 不产气 | 不产气 |
1.5.3 分离培养
将产气的发酵管分别接种于伊红美蓝琼脂平板上，于36±1℃恒温箱倒置培养18-24h。观察菌落形态。结果如表3.1和表3.2所示。黄酒接种量0.1ml，1号管没有出现可疑菌落可能原因为乳糖胆盐发酵实验操作过程中有杂菌带入。
表3.1 湖水伊红美蓝固体培养基分离培养
| 接种量(ml) | 1号管 | 2号管 | 3号管 |
| 1 | 无可疑菌落 | 有可疑菌落 | 有可疑菌落 |
| 0.1 | 有可疑菌落 | 有可疑菌落 | 有可疑菌落 |
| 0.01 | \ | 有可疑菌落 | \ |
表3.2 黄酒伊红美蓝固体培养基分离培养
| 接种量(ml) | 1号管 | 2号管 | 3号管 |
| 1 | \ | \ | \ |
| 0.1 | 无可疑菌落 | \ | \ |
| 0.01 | \ | \ | \ |
2.2.2复发酵证实实验
对分离培养得到的紫红色，具金属光泽的菌落进行革兰氏染色，同时对应接种到乳糖发酵管内进行复发酵，于36±1℃的恒温箱倒置培养24±2h，观察产气情况。结果如表表4.1所示，湖水接种量1ml的2号管，接种量0.1ml的2、3号管，接种量0.01ml的2号管为大肠菌群阳性管。查大肠杆菌最可能数(MPN)检索表，报告100ml湖水MPN为150。100ml黄酒MPN不超过30。
表4.1 湖水革兰氏染色及乳糖复发酵结果
| 接种量(ml) | 1号管 | 2号管 | 3号管 |
| 1 | \ | G+；产气 | G+；不产气 |
| 0.1 | G-；不产气 | G+；产气 | G+；产气 |
| 0.01 | \ | G+；产气 | \ |
3 讨论
对水及黄酒中微生物的检测结果报告如下：湖水细菌总数为3.7×105个/ml，100ml湖水MPN为150。黄酒细菌总数＜1×104个/ml，100ml黄酒MPN不超过30。从检测结果可知湖水细菌总数、大肠菌群均不符合饮用标准，从而提示水样提取处的湖水可能遭到粪便污染，不能直接作为人及牲畜的饮用水。黄酒细菌总数＜1×104个/ml，由于用于检测的黄酒稀释倍数过高，不能很好的指示黄酒中细菌总数是否符合标准，以后实验应选取较小的稀释倍数对黄酒进行检测以提高黄酒检测的可信度。
从上述实验可知，依靠传统的增菌、分离、生化鉴定方法。虽然它具有准确率较高的优点，但是该方法具有以下一些明显的缺点：检测周期长，一般说来鉴定一种细菌需要7-10 d；程序复杂，细菌学培养方法需经富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定等过程。其灵敏度也受杂菌干扰的一定影响，存在一定的假阴性,而且无法对人工难以培养的病原细菌进行检测，已远远不能满足现代检测要。近年来许多研究者发表了基于PCR技术的检测水中大肠杆菌的实验方法，结合PCR技术和基因探针，能特异性地检测大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌。分子生物学的检测方法以其检测周期短，特异性高等特点在不久的将来必将替代常规检测方法。
