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赛默飞创新技术应用系列之双三元液相色谱DGLC(一)

放大字体  缩小字体 世科网   发布日期:2013-10-09  浏览次数:781
核心提示:随着蛋白组学、代谢组学、相互作用组学及中药现代化研究的不断深入,复杂体系分离已成为分析化学研究的热点和难点之一。Davis和G
随着蛋白组学、代谢组学、相互作用组学及中药现代化研究的不断深入,复杂体系分离已成为分析化学研究的热点和难点之一。Davis和Gidding利用重叠统计学理论指出,当色谱峰的个数超过峰容量的37%时,分离度就会大大下降。随着色谱柱技术的迅速发展,采用亚二微米及表面增强核技术虽然可以大大提高色谱分辨能力,但很多样品的复杂程度远远超过了一维色谱的分离能力。在这样情况下,结合多种分离手段,能够提高系统分辨能力,增加峰容量,擅长于复杂样品分析的二维或多维色谱分离技术,成为液相色谱发展的重要方向。
 
在线二维或多维色谱分离的实现往往需要复杂仪器系统的配置和管路连接,并需要软件的繁琐设置和支持,等等这些原因极大地制约了二维或多维色谱分离技术的应用。赛默飞UltiMate 3000双三元液相色谱作为2006年匹兹堡金奖产品,采用独特的双泵设计,每个泵都作为一个单独的体系,有各自独立的比例阀和流动相体系,可同时单独控制三种不同的流动相,在Chromeleon变色龙软件的控制下,结合独特的阀切换技术,通过灵活的流路连接设计,可以轻松实现在线二维或多维色谱分离等高级应用,帮您解决复杂体系的分离难题。

UltiMate 3000双三元液相色谱二维色谱分析示意图


Chromeleon变色龙软件方法编辑向导
极大提高系统分离度,减少色谱峰重叠
通过一维和二维分离选择性的差异(正交性),可以扩大分离空间,提高系统分离度,最大限度地减少色谱峰的重叠现象。系统分离度公式:
其中RS为系统分离度,Rx和Ry分别为一维和二维的分离度。

基于在线固相萃取技术的二维色谱分离应用

苏丹红(Sudan dyes)是一种人工合成的偶氮类、油溶性的化工染料,禁用于食品着色,通常有苏丹红I、II、III、IV,四种苏丹红都有致癌毒性。国标GB/T19681-2005在分析检测苏丹红时使用正己烷萃取,碱性氧化铝净化,有机溶剂消耗量大,步骤十分繁琐,且由于氧化铝的活化程度直接影响净化效果,造成方法重现性不能令人满意。
 
采用二维色谱分离结合在线固相萃取技术可方便的完成辣椒油等复杂基质样品中四种苏丹红的测定。样品从左泵进样后在一维色谱柱中实现初步分离净化,去除基质干扰物质,然后分别将目标分析物中心切割至SPE小柱中浓缩,最后通过右泵的流动相体系将SPE柱中的目标物洗脱至第二维的分析柱中进行UV+MS的分析测定。系统流程图见图2.

图2. 全自动二维色谱结合在线固相萃取系统流程图(方法开发时通过流路①使用DAD检测器;检测样品时通过流路②使用MS检测器)


图3辣椒油样品紫外色谱图
a)       混合标准溶液(4个组分均为2 mg/mL);b) 加标辣椒油样品(苏丹红组分均为6 mg/mL);
(其中1 苏丹红I,2 苏丹红II,3 苏丹红III,4 苏丹红IV,二维色谱数据采集时间10min )


图4辣椒油样品的质谱总离子流色谱图
(其中1 苏丹红I,2 苏丹红II,3 苏丹红III,4 苏丹红IV)
a)空白(乙腈);b) 混合标准溶液(苏丹红II、III浓度为5 μg/L,苏丹红I、IV浓度为15 μg/L);c) 辣椒油样品;d) 加标辣椒油样品(苏丹红I、III浓度为10 μg/L,苏丹红II、IV浓度为30 μg/L)

基于阀切换技术的二维色谱分离运用

中药苦荞麦是蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum Mill) 一年生或多年生草本植物,具有降血糖、降血脂、降尿糖等作用。系统的化学成分研究表明其含有很多结构类似的黄酮苷、酚苷和酰胺类化合物,采用常规分离,色谱峰容量有限,峰重叠现象严重。采用二维色谱分离技术,提高了系统峰容量,改善了系统分离度,同时对其中12个组分进行了定量,该方法对中药的质量评价具有重要意义。
 
首先DGLC的左泵将样品带到Hilic-10小柱中实现粗分,将保留相对较弱的成分洗脱至PAⅡ C18柱上实现分离;再把Hilic-10小柱中保留相对较强的组分洗脱至phenyl 柱中实现分离;利用分析柱后的一个2位阀实现UV检测器的共用,从而轻松完成所有组分的定量分析。 

图5 仪器系统连接图


图6 苦荞麦二维分离谱图
在线全二维色谱分离的实现

全二维色谱分离模式是指一维色谱分离的全部馏分连续的、直接的通过八通或十通阀注入到二维分离系统中;每个馏分都经过两种不同的分离方法;且在获得最佳二维分辨率的同时,第一维的分辨率维持不变。它适合复杂组分的分析,可获得更多的样品组分信息。全二维分析的数据呈现过程见图7.。

图7全二维色谱的数据呈现过程


图8 典型的全二维色谱连接图
 
刺五加是五加科五加属的一种落叶灌木,主要的药用部分是它的根及根皮,药材名又称五加参, 是中药五加皮的一种。其系统的化学研究已比较深入,主要含有甾体类、香豆素类 、木质素类、酚类、糖类、三萜类及有机酸、微量元素等。采用全二维液相色谱分离技术结合质谱对刺五加水提取物进行系统的物质基础分析。与一维色谱分离比较,全二维色谱的峰容量大大提高。实验结果初步显示出全二维液相色谱串联质谱分离分析体系的高峰容量、高灵敏度和自动化等特点,为中药复杂体系的分离分析提供了一种可靠的方法。
 

图9 刺五加混合对照品和药材样品3D谱图
(其中1 绿原酸;2 紫丁香苷;3 紫丁香苷;4 异嗪皮啶;5 紫丁香苷E )
这些应用实例展现了赛默飞UltiMate 3000双三元液相色谱在实现二维及全二维色谱分离技术上的优势,结合Chromeleon变色龙软件的方法编辑向导可以轻松实现二维及全二维色谱操作。此外从纳升液相、常规液相、超快速液相到生物液相所有系统均可提供双三元液相色谱以满足不同的分析需求。

参考文献
1、二维液相色谱分析婴幼儿配方奶粉中维生素ADE
2、二维液相色谱技术纯化和分析单克隆抗体
3、2D-UHPLC分析苦荞麦中12个主要化学成分
4、全自动在线固相萃取-二维高效液相与质谱联用法测定辣椒油的苏丹红
5、在线全二维液相色谱串联质谱分析刺五加提取物成分
6、Xiaoliang Cheng, Liping Guo, Zaiquan Li, et al. A HPLC method for simultaneous determination of 5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside and ITs active metabolite 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribotide in tumor-bearing nude mice plasma and its application to pharmacokinetics study [J]. J Chromatogr B, 2013, 915– 916: 64–70.

赛默飞创新技术应用系列之双三元液相色谱DGLC集锦
(一)二维及全二维液相色谱分离技术应用
(二)在线固相萃取技术
(三)流动相在线除盐技术
(四)在线柱后衍生和反梯度补偿技术

 

关于赛默飞世尔科技

赛默飞世尔科技(纽约证交所代码: TMO)是科学服务领域的世界领导者。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额130亿美元,员工约39,000人。主要客户类型包括:医药生物技术公司、医院和临床诊断实验室、大学、科研院所和政府机构,以及环境与过程控制行业。借助于Thermo Scientific、Fisher Scientific和Unity™ Lab Services三个首要品牌,我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合,为客户、股东和员工创造价值。我们的产品和服务帮助客户解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战,促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。欲了解更多信息,请浏览公司网站:www.thermofisher.com
 
关于赛默飞世尔科技中国

赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年,在中国的总部设于上海,并在北京广州香港台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司,员工人数超过2400名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等,提供实验室综合解决方案,为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求,现有5家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在北京和上海共设立了5个应用开发中心,将世界级的前沿技术和产品带给国内客户,并提供应用开发与培训等多项服务;位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术,研发适合中国的技术和产品;我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队,在全国有超过400 名经过培训认证的、具有专业资格的工程师提供售后服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息,请登录网站:www.thermofisher.cn


 
  来源:赛默飞
文章出自: 世科网
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