摘要:建立了同时检测化妆品中24种防腐剂含量的反相高效液相色谱法(RP2HPLC)。采用KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,以磷酸盐缓冲溶液(pH=4.26)为流动相,梯度洗脱。样品经甲醇超声提取,然后采用RP2HPLC2二极管阵列检测法测定,对样品前处理和色谱条件进行研究和优化。方法的相对标准偏差为1.3%～3.3%;回收率为90.6%～97.8%;各种防腐剂的线性相关系数≥0.9997,具有较高的准确度和精密度,可用于化妆品中24种防腐剂含量的分析。
关键词:反相高效液相色谱,化妆品,防腐剂
1引言
化妆品中的防腐剂是为了使化妆品在生产、使用和保存过程中免受微生物污染的一类化妆品添加剂。但大多数防腐剂对人的皮肤会产生不同程度的刺激。因此,化妆品中防腐剂的用量必须以安全性作为前提。我国《化妆品卫生规范》对化妆品中防腐剂的使用浓度和范围做了相关的规定。目前,国内外对化妆品中防腐剂的测定一般多采用高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱法、胶束电动色谱法、毛细管电泳法和伏安法等,而同时测定的防腐剂一般仅为4～8种,最多可同时测定18种,采用的方法均为气相色谱-质谱法。
本实验研究了化妆品中的24种常用防腐剂的样品前处理方法和HPLC分离条件,建立了化妆品中24种常用防腐剂同时检测的HPLC法。结果表明,本方法简便、快速、准确,应用于实际化妆品中防腐剂的测定,结果满意。
2实验部分
2.1仪器与试剂
高效液相色谱仪(美国Agilent1100系列),由四元低压泵、柱温箱、二极管阵列检测器及自动进样器组成;KQ-600型超声波清洗仪器(昆山市超声仪器有限公司)。
对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、水杨酸、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、苯甲醇、苯氧基乙醇、4-氯-3-甲苯酚、三氯生及三氯卡班(Sigma公司);苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苯酯及溴硝丙醇(AcrosOrgnics公司);2,4-二氯-3,5-二甲酚、对羟基苯甲酸异丙酯、2-苯酚、4-氯-3,5-二甲酚、对羟基苯甲酸异丁酯及2-苄基-4-氯酚(东京化成工业株式会社);苯甲酸、山梨酸(国家标准物质中心)。乙腈为色谱纯,甲醇为优级纯;无水乙醇、四氢呋喃等试剂均为国产分析纯;Millipore超纯水。
2.2标准品混合溶液和供试品溶液的制备
分别准确称取一定量的24种防腐剂标准品,用甲醇溶液定容,配制成2g/L的标准储备液。分别移取一定体积的上述标准储备液至100mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配成混合标准储备液。准确称取化妆品0.2g(精确到0.001g)于50mL锥形瓶中,加入10mL甲醇,超声提取30min,取部分溶液放入离心管中,在离心机上以5000r/min高速离心10min后,取上清液经0.22μm滤膜过滤,滤液供RP-HPLC检测。
2.3色谱条件
色谱柱:伊利特KromasilC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:A.甲醇,B.0.025mol/LNaH2PO4溶液,pH4.26。线性梯度洗脱条件见表1。流速:1.0mL/min;柱温:25℃;检测波长:程序可变波长扫描;进样量:10μL。
3结果与讨论
3.1流动相的选择
3.1.1缓冲溶液pH的选择在24种防腐剂中,受pH影响的只有苯甲酸、山梨酸和水杨酸。因此,着重考察了不同pH值(2.5～5.5)对以上3种酸分离情况的影响。发现在pH4.26时,苯甲酸、山梨酸和水杨酸能与溴硝丙醇、苯甲醇、苯氧基乙醇和对羟基苯甲酸甲酯达到很好的分离,峰形良好。
3.1.2NaH2PO4浓度的选择在考察了0.01、0.025和0.05mol/LNaH2PO4溶液对分离的影响后,发现0.025mol/LNaH2PO4可达到较好的分离,且峰形良好。
3.2检测波长的选择
通过全波长扫描可得到24种物质各自的吸收图谱。综合各物质在不同波长下的响应值和不同波长对基线的影响,最终确定采用程序可变波长进行扫描,即根据不同组分的出峰顺序,在不同时间段,分别用各组分的最佳吸收波长进行检测,从而提高检测的灵敏度,达到最佳的扫描效果。
3.3样品提取方法的选择
3.3.1样品提取溶剂的选择在相同的色谱条件下,比较了甲醇、乙醇、四氢呋喃和流动相等4种溶剂对不同种类化妆品(膏霜类、水类、固体类)的提取效果。结果表明,乙醇和四氢呋喃提取后的色谱图在2.0～4.5min的色谱峰的峰形欠佳,无法准确计算溴硝丙醇和水杨酸的含量,而流动相提取口红时,不能将口红完全溶解,且在28.26min时基线干扰较大,影响被测物质含量的测定。从提取结果可看出,乙醇、四氢呋喃和流动相对某些物质的提取率偏低,而甲醇对各物质的提取率都较高,提取效果最佳,因此选择甲醇作为样品超声提取的溶剂。
3.3.2超声波提取时间的选择研究了10～60min不同时间段内,超声波的提取率。发现30min以上对提取率没有明显增大,且随着超声时间的延长,会使超声波仪器内的水温上升,导致某些易挥发的成分挥发,反而降低了提取率。所以,综合考虑,选择30min为超声提取时间。图1是24种防腐剂在确定的色谱条件下的液相色谱图。
3.4线性关系、检出限、回收率和精密度
在确定的最佳分离色谱条件下,配制一系列不同浓度的混合标准溶液进行色谱测定,以各组分的峰面积(Y)对浓度X(mg/L)绘制标准曲线。当信噪比(S/N)为3时,测得各防腐剂组分的检出限。各组分的线性方程、相关系数和检出限。
称取3种经测定含防腐剂较少,且基线干扰较小的化妆品0.2g(精确到0.001g),分别添加高、中、低3个浓度水平的混合标准溶液,每种样品重复6次,按上述实验条件进行样品处理和测定,计算回收率和精密度。
3.5实际样品分析
用所建立的检测方法,对膏霜类、水类和固体类等9个实际化妆品样品进行测定,以标准样品色谱图中各防腐剂的保留时间对化妆品中的防腐剂进行定性,以样品中各防腐剂色谱峰的峰面积与标准曲线相对应进行定量分析。表4仅列出了9个化妆品中检测出的9种防腐剂的结果(其余15种防腐剂均未检出)。从结果可以发现,大多数化妆品中都含有对羟基苯甲酸酯类和苯氧基乙醇,其它种类的防腐剂较少。其中以对羟基苯甲酸甲酯最常见,含量也较高。
综上所述,采用超声波提取,高效液相色谱分析,程序可变波长检测,同时测定化妆品中24种常用防腐剂含量的方法,操作简便,结果可靠。用于化妆品质量控制,及进出口化妆品检验具有重要意义。
关键词:反相高效液相色谱,化妆品,防腐剂
1引言
化妆品中的防腐剂是为了使化妆品在生产、使用和保存过程中免受微生物污染的一类化妆品添加剂。但大多数防腐剂对人的皮肤会产生不同程度的刺激。因此,化妆品中防腐剂的用量必须以安全性作为前提。我国《化妆品卫生规范》对化妆品中防腐剂的使用浓度和范围做了相关的规定。目前,国内外对化妆品中防腐剂的测定一般多采用高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱法、胶束电动色谱法、毛细管电泳法和伏安法等,而同时测定的防腐剂一般仅为4～8种,最多可同时测定18种,采用的方法均为气相色谱-质谱法。
本实验研究了化妆品中的24种常用防腐剂的样品前处理方法和HPLC分离条件,建立了化妆品中24种常用防腐剂同时检测的HPLC法。结果表明,本方法简便、快速、准确,应用于实际化妆品中防腐剂的测定,结果满意。
2实验部分
2.1仪器与试剂
高效液相色谱仪(美国Agilent1100系列),由四元低压泵、柱温箱、二极管阵列检测器及自动进样器组成;KQ-600型超声波清洗仪器(昆山市超声仪器有限公司)。
对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、水杨酸、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、苯甲醇、苯氧基乙醇、4-氯-3-甲苯酚、三氯生及三氯卡班(Sigma公司);苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苯酯及溴硝丙醇(AcrosOrgnics公司);2,4-二氯-3,5-二甲酚、对羟基苯甲酸异丙酯、2-苯酚、4-氯-3,5-二甲酚、对羟基苯甲酸异丁酯及2-苄基-4-氯酚(东京化成工业株式会社);苯甲酸、山梨酸(国家标准物质中心)。乙腈为色谱纯,甲醇为优级纯;无水乙醇、四氢呋喃等试剂均为国产分析纯;Millipore超纯水。
2.2标准品混合溶液和供试品溶液的制备
分别准确称取一定量的24种防腐剂标准品,用甲醇溶液定容,配制成2g/L的标准储备液。分别移取一定体积的上述标准储备液至100mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配成混合标准储备液。准确称取化妆品0.2g(精确到0.001g)于50mL锥形瓶中,加入10mL甲醇,超声提取30min,取部分溶液放入离心管中,在离心机上以5000r/min高速离心10min后,取上清液经0.22μm滤膜过滤,滤液供RP-HPLC检测。
2.3色谱条件
色谱柱:伊利特KromasilC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:A.甲醇,B.0.025mol/LNaH2PO4溶液,pH4.26。线性梯度洗脱条件见表1。流速:1.0mL/min;柱温:25℃;检测波长:程序可变波长扫描;进样量:10μL。
3结果与讨论
3.1流动相的选择
3.1.1缓冲溶液pH的选择在24种防腐剂中,受pH影响的只有苯甲酸、山梨酸和水杨酸。因此,着重考察了不同pH值(2.5～5.5)对以上3种酸分离情况的影响。发现在pH4.26时,苯甲酸、山梨酸和水杨酸能与溴硝丙醇、苯甲醇、苯氧基乙醇和对羟基苯甲酸甲酯达到很好的分离,峰形良好。
3.1.2NaH2PO4浓度的选择在考察了0.01、0.025和0.05mol/LNaH2PO4溶液对分离的影响后,发现0.025mol/LNaH2PO4可达到较好的分离,且峰形良好。
3.2检测波长的选择
通过全波长扫描可得到24种物质各自的吸收图谱。综合各物质在不同波长下的响应值和不同波长对基线的影响,最终确定采用程序可变波长进行扫描,即根据不同组分的出峰顺序,在不同时间段,分别用各组分的最佳吸收波长进行检测,从而提高检测的灵敏度,达到最佳的扫描效果。
3.3样品提取方法的选择
3.3.1样品提取溶剂的选择在相同的色谱条件下,比较了甲醇、乙醇、四氢呋喃和流动相等4种溶剂对不同种类化妆品(膏霜类、水类、固体类)的提取效果。结果表明,乙醇和四氢呋喃提取后的色谱图在2.0～4.5min的色谱峰的峰形欠佳,无法准确计算溴硝丙醇和水杨酸的含量,而流动相提取口红时,不能将口红完全溶解,且在28.26min时基线干扰较大,影响被测物质含量的测定。从提取结果可看出,乙醇、四氢呋喃和流动相对某些物质的提取率偏低,而甲醇对各物质的提取率都较高,提取效果最佳,因此选择甲醇作为样品超声提取的溶剂。
3.3.2超声波提取时间的选择研究了10～60min不同时间段内,超声波的提取率。发现30min以上对提取率没有明显增大,且随着超声时间的延长,会使超声波仪器内的水温上升,导致某些易挥发的成分挥发,反而降低了提取率。所以,综合考虑,选择30min为超声提取时间。图1是24种防腐剂在确定的色谱条件下的液相色谱图。
3.4线性关系、检出限、回收率和精密度
在确定的最佳分离色谱条件下,配制一系列不同浓度的混合标准溶液进行色谱测定,以各组分的峰面积(Y)对浓度X(mg/L)绘制标准曲线。当信噪比(S/N)为3时,测得各防腐剂组分的检出限。各组分的线性方程、相关系数和检出限。
称取3种经测定含防腐剂较少,且基线干扰较小的化妆品0.2g(精确到0.001g),分别添加高、中、低3个浓度水平的混合标准溶液,每种样品重复6次,按上述实验条件进行样品处理和测定,计算回收率和精密度。
3.5实际样品分析
用所建立的检测方法,对膏霜类、水类和固体类等9个实际化妆品样品进行测定,以标准样品色谱图中各防腐剂的保留时间对化妆品中的防腐剂进行定性,以样品中各防腐剂色谱峰的峰面积与标准曲线相对应进行定量分析。表4仅列出了9个化妆品中检测出的9种防腐剂的结果(其余15种防腐剂均未检出)。从结果可以发现,大多数化妆品中都含有对羟基苯甲酸酯类和苯氧基乙醇,其它种类的防腐剂较少。其中以对羟基苯甲酸甲酯最常见,含量也较高。
综上所述,采用超声波提取,高效液相色谱分析,程序可变波长检测,同时测定化妆品中24种常用防腐剂含量的方法,操作简便,结果可靠。用于化妆品质量控制,及进出口化妆品检验具有重要意义。
