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近日,蒙牛纯牛奶被检测出强致癌物——黄曲霉毒素M1,消息一出顿时又掀起一股食品安全隐患的讨论。相比之前的三聚氰胺,黄曲霉素是否更难检测?现已整理出全套的专业检测方案,让乳和乳制品中黄曲霉毒素M1无处躲藏。 Jc, {n* <'<{|$Pw 1. 试用范围 ]y<<zQ_fhY 牛奶,奶粉,发酵乳,干酪,奶油等乳制品 Oxr?y8C~ @(s"5i.`) 2. 方法原理 "~aCW~ 黄曲霉毒素M1易溶于极性溶剂,因此均匀基质中的黄曲霉毒素M1可以通过甲醇/水震荡分散提取,对于高脂肪/油含量的样品基质加入正己烷予以脱脂。本方法采用免疫亲和柱净化,荧光检测器测定乳制品中黄曲霉毒素M1。 2z[A&s_ AV^Sla7|_ 3. 所需设备和耗材 O)9{qU:[b 黄曲霉毒素免疫亲和柱:Welchrom® IAC (1ml,25支/盒;3ml,15支/盒)(上海月旭提供);
yf7$m_$C' 高效液相装置带荧光检测器; A+bU{oLr 均质机; x@480r 水平振荡器; ~$Pz`amT| SPE转接头及50ml大容量上样器:Welchrom® SPE Adapter; E
T}Dh3A 分析天平(精度0.02 g); BjIKs~CT SPE装置带抽真空系统:Welchrom® SPE Device; q$6Tb 黄曲霉毒素M1标准品; Ye) F{WqZ# PBS 缓冲溶液:称取1.16 g Na2HPO4,0.20 g KH2PO4,8 g NaCl和0.2 g KCl 溶于900ml水中,用HCL或NaOH调节pH至7.4,然后定容至1000ml; 8m;tgMFO 甲醇(色谱纯); 7iBN!"G0 乙腈(色谱纯); XB'PEvh8 正己烷(分析纯)。 Gw)>i45: =g+Rk+ jn 4. 样品前处理 }Pn]j7u! 称取25g(精确至0.01 g)混匀的样品,置于50 mL具塞离心管中,水浴加热至35℃~37 ℃,6000 r/min下离心10 min。收集全部上清液,待净化; o7;#B)jWS 称取25 g(精确至0.01 g)混匀的样品,用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4,9500r/min下均质5 min,水浴加热至35℃~37 ℃,6000 r/min下离心10 min。收集全部上清液,待净化。 ET 2@dY~ 称取10 g(精确至0.01 g)样品置于250 mL烧杯中,加入50 mL约50 ℃的水于乳粉中,玻璃棒搅拌均匀。溶解后冷却至室温,移入100 mL容量瓶中,水洗烧杯并转移洗涤液,用PBS定容至刻度后装入离心管6000转/分钟下离心15 min,混合上清液,取50mL上清液待净化。 y,QJy=? 切取均质的样品5g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加2 mL水和30 mL甲醇,9500 r/min下匀浆5 min,超声提取30 min,6000r/min下离心10 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中,同时加入30 mL正己烷,振摇2 min,分层后,弃去正己烷层。重复用正己烷提取2次。提取液减压浓缩至约2 mL,转移浓缩液至离心管,烧瓶用甲醇-水溶液(1+4)5 mL分2次洗涤并倒入50 mL离心管中,加PBS溶液稀释至50 mL,6000r/min下离心5 min,上清液待净化。 _M;M-hk/ 称取5g(精确至0.01 g)试样,置于50 mL烧杯中,用20 mL正己烷将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇,振荡30 min后,将全部液体移于分液漏斗中,待分层后,将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中,旋转蒸发仪减压浓缩至约5 mL,加PBS稀释至约50mL,待净化。 yq2pg8% Vy7o}z` 5. 免疫亲和柱净化(3cc) Dw6mSsC/ - 将IAC装于固相萃取装置上,接上大体积上样器,10ml PBS溶液活化柱子,流速保持在2–3 ml/min,确保上样前柱子保留少量(0.5ml)的PBS溶液,活化液不收集;
- 将待净化液加入免疫亲和柱,流速不超过5 mL/min,不收集流出液;
- 用约20ml去离子水淋洗柱子,流速不超过5 mL/min,抽真空1分钟,不收集流出液;
- 用1.5ml甲醇洗脱,流速控制在1d/s,收集洗脱液过膜后上机测试。
注:免疫亲和柱从冰箱去除需升到室温后使用 -*T<^G;rK UfWn\*J&k 6. 色谱条件: F6\Hqv 色谱柱: Ultimate® XB-C18 250 mm x 4.6 mm,5µm(上海月旭提供) aX$Q}mgb 预柱: Ultimate® C18,5µm,ULT5BG18(上海月旭提供) Lradyo44u\ 流动相: 水:甲醇:乙腈=11:4:5 C[xY 0<^B 柱温: 35℃ ?|;q=p`t- 检测波长: 发射波长:365nm,激发波长:450nm %!X|X,b^O 进样量: 100µL qXw^y M)JKe!0ad1 附:测试谱图 yxx'g+D*
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