实验室常用缓冲液介绍 [复制链接]

4．凝胶加样缓冲液 8H&_,;
  

缓冲液类型	6×缓冲液	贮存温度
:Pj W:]   Ⅰ	0.25%溴酚蓝	-B<O_*wOj   4℃
	0.25%二甲苯青FF
	40%（W/V）蔗糖水溶液
YJ&lB&xH   Ⅱ	0.25溴酚蓝	L$oia)%t-   室温
	0.25%二甲苯青FF
	15%聚蔗糖(Ficoll400)
7}2sIf[I   Ⅲ	0.25%溴酚蓝	HA$^ *qn   4℃
	0.25%二甲苯青FF
	30%甘油水溶液
}:,o Y<   Ⅳ	0.25%溴酚蓝	&:!ZT=   4℃
	40%(W/V)蔗糖水溶液
	碱性加样缓冲液:
	300mmol/L NaOH
	6mmol/L EDTA
o2[vM$]   Ⅴ	18%聚蔗糖(Ficoll400)	LUe>)eqw   4℃
	0.15%溴甲酚绿
	0.25%二甲苯青FF

C8bGae(  
　　使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。 reqfgNg  
　　选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。 I,CAFq  

5．各种pH值的Tris缓冲液的配制 }g WSV  

各种pH值的Tris缓冲液的配制
所需pH值（25℃）	0.1mol/L HCl的体积
7．1	45．7
7．2	44．7
7．3	43．4
7．4	42．0
7．5	40．3
7．6	38．5
7．7	36．6
7．8	34．5
7．9	32．0
8．0	29．2
8.1	26.2
8.2	22.9
8.3	19.9
8.4	17.2
8.5	14.7
8.6	12.4
8.7	10.3
8.8	8.5
8.9	7.0

# k+Ggw  
　　某一特定pH值的0.05mol/L Tris缓冲液的配制：将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水将体积调至100ml NLDmZr
a  
　　（2）温度对50mmol/L Tris·HCl液pH值的影响 m{={
a5GD  

4℃	25℃	37℃
8．1	7．5	7．2
8．2	7．6	7．3
8．3	7．7	7．4
8．4	7．8	7．5
8．5	7．9	7．6
8．6	8．0	7．7
8．7	8．1	7．8
8．8	8．2	7．9
8．9	8．3	8．0
9．0	8．4	8．1
9．1	8．5	8．2
9．2	8．6	8．3
9．3	8．7	8．4
9．4	8．8	8．5

（6）常用缓冲液的pKa值 vdaG?+_o  

缓冲液	分子量	pKa值	缓冲范围
Trisa	12.1	8.08	7.1～7.9
HEPESb	283.3	7.47	7.2～8.2
MPOSc	209.3	7.15	6.6～7.8
PIPESd	304.3	6.76	6.2～7.3
MESe	195.2	6.09	5.4～6.8

u
a!43Bp  
　　a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。 9)*218.  
　　7．温度对常用缓冲液pH的影响 x8!uI)#tS  

缓冲体系	pKa(20℃)	△pKa/10℃
Mes	6.15	-0.110
Ada	6.60	-0.110
PiPes	6.80	-0.085
Aces	6.90	-0.200
Bes	7.15	-0.160
Mops	7.20	-0.013
Tes	7.50	-0.200
Hepes	7.55	-0.014
Tricine	8.15	-0.210
Tris	8.30	-0.310
Bicine	8.35	-0.180
Glycylglycine	8.40	-0.280

　三、常用酶的配制 r Zg(%6@  
　　1．溶菌酶 (svKq(X  
　　用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于-20℃。每一小份一经使用后便予丢弃。 ZXC_kmBN/  
　　2．蛋白水解酶类 k
B-]SD#  

	贮存液	贮存温度	反应浓度	反应缓冲液	温度	预处理
				0.01mol/L Tris(pH7.8)
链霉蛋白酶a	20mg/ml	-20℃（溶于水）	1mg/ml	0.01mol/L EDTA	37℃	自消化b
				0.5% SDS
				0.01mol/L Tris(pH7.8)
蛋白酶Kc	20mg/ml	-20℃（溶于水）	50μg/ml	0.005mol/L EDTA	37～56℃	无须预处理
				0.5% SDS

bO+]1nZ.  
　　a：链霉蛋白酶是从链球菌（Streptomyces griseus）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。 +D d!  
　　b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下：把该酶的粉末溶解于10mmol./l Tris·HCl(pH7.5)、10mmol/l NaCl中，配成20mg/ml浓度，于37℃温育1h。经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存-20℃。 jhH&}d9  
　　c：蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）中纯化得到。该酶有两个Ca²⁺结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca²⁺，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA（以抑制依赖于Mg²⁺的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l Ca²⁺而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGT（pH8.0）至终浓度为2mmol/L,以鳌合Ca²⁺。 4n6t(/]b<  
　　3．无DNA酶的RNA酶 -1}&\=8M  
　　将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/l Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。 z^u*e  

四、常用抗生素溶液 eYv+tjIF  

KF`m OSP   抗生素	贮存液a		工作浓度
	浓度	保存条件	严紧型质粒	松弛型质粒
氨苄青霉素	50mg/ml(溶于水)	-20℃	20μg/ml	60μg/ml
羧苄青霉素	50mg/ml(溶于水)	-20℃	20μg/ml	60μg/ml
氯霉素	34mg/ml(溶于乙醇)	-20℃	25μg/ml	170μg/ml
卡那霉素	10mg/ml(溶于水)	-20℃	10μg/ml	50μg/ml
链霉素	10mg/ml(溶于水)	-20℃	10μg/ml	50μg/ml
四环素b	5mg/ml(溶于乙醇)	-20℃	10μg/ml	50μg/ml

^)3=WD'!  
　　a：以水为溶剂的抗生素贮存液通过0.22μm滤器过滤除菌。以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。 2nSz0 .  
　　b：镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如LB培养基）。 G[P<!6Id!p  
　　五、常用贮存液的配制 +#@2,  
　　1．30%丙烯酰胺溶液 RRGs:h@;  
　　【配制方法】 `O?j -zR  
　　将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。 2j[;M-3  
　　【注意】 h;J%Z!Rjw  
　　丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。 1]7v3m  
　　一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman 1号滤纸过滤以纯化之。 {=P}c:iW  
　　在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。 2K{)8;^  
　　2．40%丙烯酰胺 -L2%,.E>4  
　　【配制方法】 AD"L
>7  
　　把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。 x< ) T,c5Y  
　　【注意】 6 $+b2&V  
　　见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。 xx[l #+:c  
　　3．放线菌素D溶液 OJ)XJL  
　　【配制方法】 Pb/[945  
　　把20mg放线菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD⁴⁴⁰值。放线菌素D（分子量为1255）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182，放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20℃。

【注意】 Z.b}  
　　放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。 FYI*44E  
　　药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。 FC:Z9{2!  
　　4．0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液 v+NdO$o  
　　【配制方法】 2NHkK_B1P  
　　在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH调至pH值至7.0，用蒸馏水定容1ml，分装成小份保存于-70℃ jP?YV  
　　5．10mol/L乙酸酰溶液 Bb5|+bP  
　　【配制方法】 =.=4P~ T&  
　　把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。 *=Ko"v }  
　　6．10%过硫酸铵溶液 Mu,}?%  
　　【配制方法】 n[~kcF  
　　把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4℃保存数周。 UF3g]>*  
　　7．BCIP溶液 < Y5pAStg  
　　【配制方法】 J!O{.
v  
　　把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃ rI/;L<c  
　　8．2×BES缓冲盐溶液 5Lmhip  
　　【配制方法】 +m|S7yr'  
　　用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na₂HPO₄，室温下用HCl调节　该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成小份，保存于-20℃。 uY{zZ4iw  
　　9．1mol/L CaCl₂溶液 B|\pzWD%  
　　【配制方法】 $ z4JUr!m  
　　在200ml蒸馏水中溶解54g CaCl₂·6H₂O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20℃。 (T290a9y>  
　　【注意】 ~3f`=r3/.  
　　制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷至0℃。 Uq}FrK}  
　　10．2.5mol/L CaCl₂溶液 NOC8h\s}(  
　　【配制方法】 8IeE7  
　　在20ml蒸馏水中溶解13.5g CaCl₂·6H₂O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。 eo#2n8I>=1  
　　11．1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液 fGZZ['E  
　　【配制方法】 DGc5Lol~  
　　用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。 g6AEMer  
　　【注意】 Jw+k=>  
　　DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。 !t;B.[U *  
　　12．脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液 bjL8Wpk  
　　【配制方法】 ' ?4\  
　　把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/l Tris碱分别调节　每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH试纸检测），把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP，分装成小份贮存于-70℃。 4MFdhJoN  

碱基	波长（nm）	消化系数（ε）[L/（mol·cm）]
A	259	1.54×104
G	253	1.37×104
C	271	9.10×103
T	260	7.40×103

F.Sc2n@7-  
　　比色杯光径为1cm时,吸光度=εM

13．0.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液 k]S`A,~  
　　【配制方法】 )npvy>C'(  
　　在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H<sub>2</sub>O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节　溶液的pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。 Xvxj-\ -  
　　【注意】 A#nSK#wS61  
　　EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0，才能完全溶解。 vxXrVPU3  
　　14．溴化乙锭（10mg/ml溶液） " l>tFa  
　　【配制方法】 O@-(fyG  
　　在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。 QQQN}!xPj  
　　【注意】 YeB)]$'?u`  
　　小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。 ~Q+J1S]Fs  
　　15．2×HEPES缓冲盐溶液 s\q m  
　　【配制方法】 =|IY[2^  
　　用总量为90ml的蒸馏水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na₂PO₄·2H₂O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/l NaOH调节　pH值至7.05，再用蒸馏水定容至100ml。用0.22μm滤器过滤除菌，分装成5ml小份，贮存于-20℃。 /8LTM|(  
　　16．IPTG溶液 +]0/:
\(B  
　　【配制方法】 0E/16@6=  
　　IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为238.3），在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。 .CEl{fofj  
　　17．1mol/L乙酸镁溶液 >"pHk@AWK  
　　【配制方法】 C ,#D4  
　　在800ml水中溶解214.46g四水乙酸镁，用水定容至1L过滤除菌。 }PxPJ$o  
　　18．1mol/L MgCl₂溶液 =90)=Pxd  
　　【配制方法】 }c ERCS\t  
　　在800ml水中溶解203.4g MgCl₂·6H₂O，用水定容至1L，分装成小份并高压灭菌备用。 lh* !f$2~  
　　【注意】 ; nYR~~  
　　MgCl₂极易潮解，应选购小瓶（如100g）试剂，启用新瓶后勿长期存放。 T!QAcO  
　　19．β-巯基乙醇（BME）溶液 fU^5Dl  
　　【配制方法】 k5eTfaxl  
　　一般得到的是14.4mol/L溶液，应装在棕色瓶中保存于4℃。 0"DS>:Ntk  
　　【注意】 ?xb2jZ/0X  
　　BME或含有BME的溶液不能高压处理。 " r R$2`v"  
　　20．NBT溶液 u~\ NL{  
　　【配制方法】 C&&33L  
　　把0.5g氯化氮蓝四唑溶解于10ml 70%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃。 /[>zFYaQ  
　　21．酚/氯仿溶液 %^(} fu  
　　【配制方法】 okLheF  
　　把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/L Tris·HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/l Tris·HCl(pH7.6)液层，保存于4℃。 )/uCdSDIc  
　　【注意】 0m'tPFQ|  
　　酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。所有操作均应在化学通风橱中进行。与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。 <<+Hs/ ]  
　　22．10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液 nIv/B/>pZ  
　　【配制方法】 `&>CK`%Xu  
　　用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20℃。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。 A3zO&4f ]  
　　【注意】 >@L^^-r  
　　PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。 J)_IfbY  
　　PMSF在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节　为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。

23．磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶液 :NL.#!>/  
　　【配制方法】 _yQ*  
　　在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄,用HCl调节　溶液的pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in²(1034×10⁵Pa)高压下蒸气灭菌20min。保存于室温。 >b>3M'  
　　24．1mol/L乙酸钾（pH7.5）溶液 T<*i($ [  
　　【配制方法】 `nA_WS  
　　将9.82g乙酸钾溶解于90ml纯水中，用2mol/L乙酸调节　pH值至7.5后加入纯水定容到1L，保存于-20℃。 k~#F@_  
　　25．乙酸钾溶液（用于碱裂解） cyq]-B  
　　【配制方法】 4ed+'-"m  
　　在60ml 5mol/L乙酸钾溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成钾浓度为3mol/L而乙酸根浓度为5mol/L的溶液。 0Y#S2ty  
　　26．3mol/L乙酸钠（pH5.2和pH7.0）溶液 K29]B~0%E  
　　【配制方法】 {l=!  
　　在80ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节　pH值至5.2或用稀乙酸调节　pH值至7.0，加水定容到1L，分装后高压灭菌。 SGn:f>N  
　　27．5mol/L NaCl溶液 :&X
y#.un  
　　【配制方法】 E 5PefD\m  
　　在800ml水中溶解292.2g NaCl加水定容至1L，分装后高压灭菌。 2`,{IHu*!  
　　28．10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液 IpQ5
1  
　　【配制方法】 5DKR1z:  
　　在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节　溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。 |S#)[83*3  
　　【注意】 lqe;lWC0Z  
　　SDS的微细晶粒易扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS，10%SDS溶液无须灭菌。 O [GG<Um  
　　29．20×SSC溶液 |)QE+|?P  
　　【配制方法】 OL&ku &J_  
　　在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/l NaOH溶液调节　pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。 .x7d!t:(D  
　　30．20×SSPE溶液 j.X3SQb4G  
　　【配制方法】 ai[st+1  
　　在800ml水中溶解17.5g NaCl、27.6g NaH₂PO₄·H₂O和7.4g EDTA，用NaOH溶液调节　pH值至7.4（约需6.5ml 10ml/L NaOH），加水定容至1L，分装后高压灭菌。 .0;Z:x_3  
　　31．100%三氯乙酸溶液 0m_c43+^  
　　【配制方法】 GGsDR%U
 
　　在装有500g TCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（M/V）TCA。 4vcUHa|4  

32．1mol/L Tris溶液 dHJ#xmE!pP  
　　【配制方法】 TBr@F|RXiO  
　　在800ml水中溶解121.91g Tris碱，加入浓HCl调节　pH值至所需值。 %D $+Z(  
　　pH　　　HCl TD6MP9L  
　　7.4　　 70ml JoIh2PD  
　　7.6 　　60ml 2|:xb9#  
　　8.0　　 42ml p6|RV(?8  
　　应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值，加水定容至1L，分装后高压灭菌。 _+NM<o#A  
　　【注意】 ]^c]*O[8  
　　如1mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃并置备质量更好的Tris。 z(JDLd  
　　尽管多种类型的电极均不能准确测量Tris溶液的pH值，但仍可向大多数厂商购得合适的电极。 *C"-$WU3o  
　　Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1℃，pH值大约降低0.03个单位。例如：0.05mol/L的溶液在5℃、25℃、和37℃时的pH值分别为9.5、8.9和8.6。 ZCuLgCP?Z  
　　33．Tris缓冲盐溶液（TBS）（25mmol/l Tris） ux=0N]lc  
　　【配制方法】 s?pd&_kOv3  
　　在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris碱，加入0.015g酚并用HCl调至pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后在151bf/in2(1.034×10⁵Pa)高压下蒸汽灭菌20min，于室温保存。 "GY/2;