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10楼
发表于: 2012-10-30
34.X-gal溶液
lnEc5J@c>i
【配制方法】
# | `W ]
X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中,装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏,并应贮存于-20℃。X-gal溶液无须过滤除菌。
,i;kAy)
杂交试验中用于降低背景的封闭剂
-z-58FLlO
试剂
用途
Denhardt试剂
Northern杂交
使用RNA探针的杂交
单拷贝序列的Southern杂交
将DNA固定于尼龙膜上的杂交
Denhardt试剂通常配制50×贮存液,过滤后保存于-20℃。可将该贮存液10倍稀释于预杂交液(常为含有0.5%SDS和100μg/ml经变性被打断的鲑精DNA的6×SSC或6×SSPE)中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖(Ficoll,400型,Pharmacia)、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白(组分V”Sigmal),加水至终体积为500ml。
BLOTTO
Grunstein-Hogness杂交
Benton-Davis杂交
除单拷贝序列Southern杂交以外的所有Southern杂交
斑点印迹
1×BLOTT(牛乳转移技术优化液,Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer),是含5%胶脂奶粉和0.02%叠氮钠的水溶液,应保存于4℃。使用前可用预杂交液稀释25倍。BLOTTO不应与高浓度的SDS并用,因为后者会导致牛奶中蛋白质析出。如果杂交背景不合要求,可在杂交液中加入NP-40至终浓度为1%。BLOTTO不能用作Northern杂交的封闭剂,因为这一封闭剂中可能含有RNA酶,其活性之高使人无法接受。
注意:叠氮钠有毒性,取用时需戴手套小心操作。含叠氮钠的溶液应予明确标记。
肝素
Southern杂交
原位杂交
肝素(Sigma H-7005,从猪中提取的二级产品或相当等级的产品)用4×SSPE或4×SSC溶解配制成50mg/ml的浓度,保存于4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的杂交液中用作封闭剂的浓度为500μg/ml,在不含葡聚糖硫酸酯的杂交液中的浓度为50μg/ml。
经变性并被打断的鲑精DNA
southern和Northern杂交
把鲑鱼精子DNA(Sigma,Ⅲ,盐钠)溶解于水配制成10mg/ml的浓度,必要时于室温磁力搅拌2~4h助溶。把溶液中NaCl的浓度调至0.1mol/L,并用酚和酚/氯仿各抽提一次,回收水相。合DNA溶液快速通17号皮下注射针头12次,以剪切DNA。加入2倍体积用冰预冷的乙醇沉淀DNA。离心回收DNA并重溶于水,配制成10mg/ml的浓度,测定溶液的OD
260
值并计算出精确的DNA浓度,然后煮沸10min,分装成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加热5min,然后迅速在冰浴中骤冷。预杂交液中应含有100μg/ml经变性并被打断的鲑鱼精子DNA
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