婴幼儿奶粉中双氰胺的检测方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法） [复制链接]

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北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。 7/PHg)&  
针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点，本方法加大了净化材料的用量，以获得了更好的净化效果。采用新一代的Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（500mg/15mL，货号：MS-SQA02）和Venusil® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。 reu[}k~
  
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1 实验部分 @h>#cwhU  
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1.1 仪器、试剂与材料 A'[A!NL%  
高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。 k\ I$ve"*  
双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），新一代Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil^® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。 ;lYO)Z`3\  
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1.2 实验步骤 \?3];+c9  
称取1g试样于50mL具塞离心管中，加2mL水，涡旋30s，加2ml乙腈涡旋30s。再往现有的提取液中加2mL乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10mL的提取液。以4000r/min离心5min，将全部上清液加入新一代Cleanert® MAS-QuChERS管中（500mg/15mL），将MAS管上下晃动30s，然后涡旋30s后，8000r/min离心5min，取全部上清液（约10ml）于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1ml乙腈复溶，过0.22μm微孔滤膜，待测。 /jj@ =H  
注：1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀； 1+y&n?  
2.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果。 @Cz1rKU^l  
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1.3　实验条件
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1.3.1高效液相色谱法（HPLC法）： l@j!j]nE  
色谱柱：Venusil® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）； /OxF5bN2  
流动相： 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=15: 85； <n6/np!  
波长：220nm；进样量：10µl；柱温：30℃；流速：0.8mL/min。 *-P@|eg  
1.3.2 LC-MS/MS法： PMrvUM62  
（1）色谱条件： w^ DAu1  
色谱柱：Venusil® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）； F'*{Fk h  
流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0） A$5!]+  
B：乙腈； UhEnW8^bz1  
进样量：10µL；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min。

时间，min	A%	B%
0	10	90
0.4	50	50
1.8	50	50
1.9	10	90
7	10	90

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J7l1-  
*备注：本文曾尝试过多种C18色谱柱，对双氰胺没有保留，需要使用离子对试剂，但是无法用于LC-MS/MS；也曾尝试过MERCK ZIC-HILIC柱，但是得到双氰胺的峰面积偏差较大，分析原因是其具有阳离子交换基团，对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基酰胺的Venusil HILIC柱，以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。 GJ((eAS)  
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（2）质谱条件： IB?5y~+h
 
质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。

药物名称	监测离子对	DP	EP	CE	CXP
双氰胺	85.1/68.1	71	10	41	6
	85.1/43.1	71	10	41	6

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注：带“____”的监测离子对为定量离子对。 >Vg<J~[
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2.结果与讨论 >Ks|yNJ  
2.1 高效液相色谱法： Dpof~o,f  
2.1.1双氰胺的液相色谱图 lJ}lO,g  
2.1.2实际样品基质加标的线性关系和检出限 q,+d\-+  
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液； f4:gD*YT  
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL和10µg/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表4：

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	5.57min	Y=108.16X+27.827	0.9971	0.5µg/g

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U?H!:?,C  
2.1.3准确度和精密度 ` 8.d  
选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表5

平行1	平行2	平行3	平均值	RSD
82.3%	85.5%	89.1%	85.63%	3.97%

Rsqb<+7  
p]IF=~b  
2.2 LC-MS/MS法 fnwtD*``  
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2.2.1双氰胺的LC-MS/MS图 vt@.fT#e  
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2.2.2实际样品基质加标的线性关系和检出限 Tf<1Z{9  
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液； h /@G[5E  
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6：

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	2.25min	Y=3859.1X+23694	0.9900	2ng/g

2.2.3准确度和精密度 +r"{$'{^  
选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

平行1	平行2	平行3	平均值	RSD
82.5%	83.5%	89.3%	85.2%	4.31%