奶粉中雌酮、雌二醇、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮 SPE-LC/MS/MS检测方法 [复制链接]

测方法 lc$wjK[w[  
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1．实验部分： /
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1.1材料、试剂 hv`I`[/J  
Cleanert PEP吡咯烷酮化聚苯乙烯/二乙烯基苯固相萃取柱(100mg/6mL, P/N: PE1006，博纳艾杰尔科技)；Cleanert Silica CM改性硅胶固相萃取柱 ( 1000mg/6mL , P/N : CM0006，博纳艾杰尔科技) MD^,"!A  
液相色谱柱 (Halo C18 , 2.1×100mm, 2.7μm, P/N: 92812-602，博纳艾杰尔科技） oOHY+'V  
标准品：雌酮（CAS.No. 53-16-7）、雌二醇（CAS.No. 50-28-2）、醋酸甲地孕酮（CAS.No. 595-33-5）、醋酸氯地孕酮 (CAS.No. 302-22-7 )，购自中国药品生物制品检定所。 u].7+{  
1.2样品前处理方法 l,*5*1lM  
1.2.1 Cleanert PEP样品提取净化法 |BUgsE  
提取：取2g奶粉，加标，然后加12mL 80% 乙腈，涡旋混匀两分钟后，离心（90000r/min， 6min）取3mL上清液，加入9mL超纯水稀释，涡旋混匀后，待过Cleanert PEP柱净化。 U:z5`z!  
净化步骤： !S%0#d2  
1)       活化：以5mL乙腈，5mL水活化Cleanrt PEP； jfi
Uf1Mj  
2)       上样：把上述稀释后的样品溶液过柱，流速控制以1mL/min为宜； 'J$@~P  
3)       淋洗：待样品溶液完全通过小柱后，用5mL 5%乙腈淋洗小柱，然后真空抽干3min； dr(-k3ex  
4)       洗脱：以3-5mL乙腈洗脱目标，收集流出液； v2I? 5?j  
5)       浓缩：收集液以氮气浓度吹干（40℃水浴），后以50% 甲醇水定容至1mL，混匀后过0.22μm微孔滤膜过，进LC-MS/MS分析。 #N"u 0  
1.2.2 Cleanert Silica样品提取净化法 \ @fKKb|  
提取：取2g奶粉，加标，然后加12mL 乙腈，涡旋混匀两分钟后，离心（90000r/min， 6min）取3mL上清液，待过Cleanert Silica柱净化。 ] j8
bv3  
净化步骤： _-lE$
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1)       活化：以5mL乙腈活化Cleanrt Silica小柱； BM/o7%]n  
2)       上样：把上述提取液过柱，收集流出液； pY@QR? F\  
3)       淋洗：以5mL乙腈洗涤小柱，收集流出液； N[e,%heR  
4)       浓缩：合并以上流出液液，以氮气浓度吹干（40℃水浴），后以50% 甲醇水定容至1mL混匀后过0.22μm微孔滤膜，进LC-MS/MS分析。 [8a(4]4  
1.3  LC-MS/MS检测条件 >x JzV  
1.3.1 孕激素（醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮）测定 @<{%
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液相色谱条件：色谱柱 (Halo C18， 2.1×100mm, 2.7μm)；流动相：A：0.1%甲酸水，B: 甲醇，梯度条件（略）；流速：0.3mL/min，柱温：40℃,进样量：10μL :Y\ ~[Y  
参考质谱条件：电离源：电喷雾正离子模式；其他（略） E<Zf!!3  
1.3.2 雌激素（雌二醇、雌酮）测定 ?a3wBy  
液相色谱条件：色谱柱（Halo C18 2.1×100mm,2.7μm）；流动相：A：水，B: 乙腈，梯度条件（略）；流速：0.3mL/min，柱温：40℃, 进样量：10μL ;ND$4$  
参考质谱条件：电离源：电喷雾负离子模式；其他（略） 9L:wfg}8s  
2．结果与讨论： ]JjS$VMauX  
结果见图1、图2。用Cleanert PEP (反相)或Cleanert Silica CM(正相) 两种净化手段均可到达满意的回收率和净化效果，添加浓度在25ppb时回收率可达到80% 。 Jg;[k  
用Halo色谱柱可以实现样品的快速分离，大大提高工作效率。 7.hBc;%2u  
雌二醇和雌酮两种激素，质谱相应偏低，质谱条件需要进一步优化。 <"5l<E  
F<,pAxl~@  
本实验结果采用单点定量判定，结果可能有失偏颇，详细数据需做基质添加标准曲线确证，方法的精密度，稳定性等亦需要进一步确证。