测方法 7ePqmB<. Av xfI"sp 1．实验部分： Wc,~ { 1.1材料、试剂 W=#:.Xj[ Cleanert PEP吡咯烷酮化聚苯乙烯/二乙烯基苯固相萃取柱(100mg/6mL, P/N: PE1006，博纳艾杰尔科技)；Cleanert Silica CM改性硅胶固相萃取柱 ( 1000mg/6mL , P/N : CM0006，博纳艾杰尔科技)
(d(hR0HKE 液相色谱柱 (Halo C18 , 2.1×100mm, 2.7μm, P/N: 92812-602，博纳艾杰尔科技）
[`^a=:* 标准品：雌酮（CAS.No. 53-16-7）、雌二醇（CAS.No. 50-28-2）、醋酸甲地孕酮（CAS.No. 595-33-5）、醋酸氯地孕酮 (CAS.No. 302-22-7 )，购自
中国药品生物制品检定所。
\ ^ZlG. 1.2样品前处理方法 V n* 1.2.1 Cleanert PEP样品提取净化法 -u2P ?~ 提取：取2g奶粉，加标，然后加12mL 80% 乙腈，涡旋混匀两分钟后，离心（90000r/min， 6min）取3mL上清液，加入9mL超纯水稀释，涡旋混匀后，待过Cleanert PEP柱净化。
k\WR ] 净化步骤：
RLb KD> 1) 活化：以5mL乙腈，5mL水活化Cleanrt PEP；
_59huC. 2) 上样：把上述稀释后的样品溶液过柱，流速控制以1mL/min为宜；
D@
Vt^_ 3) 淋洗：待样品溶液完全通过小柱后，用5mL 5%乙腈淋洗小柱，然后真空抽干3min；
K{[%7AM 4) 洗脱：以3-5mL乙腈洗脱目标，收集流出液；
b]x4o #t 5) 浓缩：收集液以氮气浓度吹干（40℃水浴），后以50% 甲醇水定容至1mL，混匀后过0.22μm微孔滤膜过，进LC-MS/MS分析。
}HY-uQ%@g 1.2.2 Cleanert Silica样品提取净化法 =K
6($|'= 提取：取2g奶粉，加标，然后加12mL 乙腈，涡旋混匀两分钟后，离心（90000r/min， 6min）取3mL上清液，待过Cleanert Silica柱净化。
(>r[- Bft 净化步骤：
j!]YNH@ 1) 活化：以5mL乙腈活化Cleanrt Silica小柱；
8=gjY\D p 2) 上样：把上述提取液过柱，收集流出液；
N7O-2Z * 3) 淋洗：以5mL乙腈洗涤小柱，收集流出液；
i(>4wK!! 4) 浓缩：合并以上流出液液，以氮气浓度吹干（40℃水浴），后以50% 甲醇水定容至1mL混匀后过0.22μm微孔滤膜，进LC-MS/MS分析。
0a}u;gt,4w 1.3 LC-MS/MS检测条件 @JyK|.b#0 1.3.1 孕激素（醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮）测定 8 0Gn%1A9 液相色谱条件：色谱柱 (Halo C18， 2.1×100mm, 2.7μm)；流动相：A：0.1%甲酸水，B: 甲醇，梯度条件（略）；流速：0.3mL/min，柱温：40℃,进样量：10μL
WJ4li@T7V 参考质谱条件：电离源：电喷雾正离子模式；其他（略）
{
S3ZeN,kZ 1.3.2 雌激素（雌二醇、雌酮）测定 (Q.waI 液相色谱条件：色谱柱（Halo C18 2.1×100mm,2.7μm）；流动相：A：水，B: 乙腈，梯度条件（略）；流速：0.3mL/min，柱温：40℃, 进样量：10μL
bO'Sgc[] 参考质谱条件：电离源：电喷雾负离子模式；其他（略）
:=wT vz 2．结果与讨论： 2JJ"O|Ibz 结果见图1、图2。用Cleanert PEP (反相)或Cleanert Silica CM(正相) 两种净化手段均可到达满意的回收率和净化效果，添加浓度在25ppb时回收率可达到80% 。
M;p
em< 用Halo色谱柱可以实现样品的快速分离，大大提高工作效率。
ev#;t@^ 雌二醇和雌酮两种激素，质谱相应偏低，质谱条件需要进一步优化。
ML(
E o 5ZMR,SZhC 本实验结果采用单点定量判定，结果可能有失偏颇，详细数据需做基质添加标准曲线确证，方法的精密度，稳定性等亦需要进一步确证。
图1 两种孕激素总离子流图和选择离子流图（标品）
图2 两种雌激素总离子流图和选择离子流图（奶粉样品）
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