[毒素/微生物]果汁中嗜酸耐热菌的检测及控制 [复制链接]

上个世纪九十年代后期，随着中国果汁工业的发展，特别是浓缩果汁出口量的日益增长，国际市场对中国果汁的质量要求愈加严格，不断设置技术壁垒，果汁中嗜酸耐热菌便是其中之一。最初，各果汁企业，研究检测机构对这类微生物污染都缺乏认识，难以在生产环节上对其控制。随后的几年中，我们通过加强与外商、国外研究机构的联系沟通，接合果汁企业生产工艺，对果汁中这类微生物的来源及其对果汁质量会产生怎样的影响，如何检测、控制这类微生物等问题进行了深入地研究探索，协助众多果汁企业改进生产工艺条件，使其产品中嗜酸耐热菌得到了很好的控制。目前，绝大多数浓缩果汁企业的产品已能满足外商对此项指标的要求，为了能使大家更好地认识、解决果汁中嗜酸耐热菌这一技术难题，我们认为有必要对嗜酸耐热菌的特征、检测方法和工艺控制等方面的工作进行总结，以便进一步统一认识，改进产品质量。一、嗜酸耐热菌的种类和特征

浓缩果汁一般具有较低的pH值、水分活性低、糖度高等特点，在果汁加工、浓缩过程中还要经过加热处理，因此绝大多数的微生物都无法生存，只有很少的细菌、霉菌和酵母可以在浓缩果汁中存活。嗜酸耐热菌就是这少数细菌中的一类。在pH值较低时，嗜酸耐热菌可以形成具有耐热性的芽胞，果汁生产中常用的巴氏杀菌难以将其杀灭。它的芽胞以休眠的形式存活：于浓缩果汁中，当果汁复水后，适宜的条件会使芽胞萌发，生长，从而导致果汁产品香气损失、口感变差、浊度升高、形成沉淀。值得注意的是，嗜酸耐热菌存在并不一定使产品变质，未变质的果汁中也能检测到该菌，变质只在适当条件下发生，一般会引起果汁香味损失及轻微浑浊。

1984年，有科研人员从巴氏杀菌后的腐败苹果汁中分离出一种嗜酸菌，该菌可以在26～55℃温度范围pH2.6～6.0的条件下生长，它的孢子具有极强的抗热性，在较低的pH值时，工业巴氏杀菌后依然可以存活。1992年研究人员把这类嗜酸耐热菌归类于一个新的属：genus.AlicydobacJllus。目前，该属已知主要有三个种：Bacillusacidocaldarius，Bacillusacidoterrestris和Bacilluscycloheptanicus。Alicyclobacillus属的菌是严格的嗜酸菌，它们生长的pH范围为2.0～6.0，生长温度范围为40～70℃，该属菌需氧或兼性厌氧，当环境和营养条件不利时可形成内生孢子。

Alicyclobacillusacedocaldarius为需氧的革兰氏阳性杆菌，可形成内尘孢子，长2～3m，宽0.7～0.8rrm，形成5～6个细胞的短链。该种菌的孢子囊不膨胀，对热的耐受能力较弱。该种菌的生长pH范围为2.0～6.0，最适生长温度为45～70℃，不需要生长因子。该种菌菌落扁平，边缘不规则，不产生色素。该菌的主要来源为地热环境。AlicyclobacITlusacidoterrestfis为需氧的革兰氏阳性杆菌，可形成内尘孢子，长2.9～4.3pm，宽0.6～0.8rrm，内生孢子为卵形。该种菌不需要生长因子，生长温度范围为35～55℃，最佳生长温度为42～53℃，可生长的pH范围为2.2～5.8，在5％氯化钠条件下不能生长。该种菌苗落圆形，黄白色，不透明或半透明。

Alicyclobacilluscycloheptanicus为可形成内生孢子的、需氧的革兰氏阳性杆菌，细胞氏2.5～4.5um，宽0.35～0.55rrm，孢子呈卵形，孢子囊轻微膨胀。该菌菌落圆形，较小，黄白色，不透明，该种菌生长需要生长因子，其生长温度范围为40～53℃，最佳生长温度为48℃左右，可生长的pH范围为3.0～5.5，生长于含氨基酸和糖类的培养基中，二、果汁中嗜酸耐热菌的检测

文献中培养，鉴别嗜酸耐热菌的培养基有很多种，目前各企业常用的有YSG培养墓，BSSA培养基、BAT培养基等。BSSA培养基的主要成分为：

水合氯化钙0.25g七水合硫酸镁0.50g硫酸胺0.20g磷酸二氢钾3.0g

酵母提取物2.0g葡萄糖1.0g可溶性淀粉2.0g微量扩物质元素适量

将各组分溶解于1000ml蒸馏水中，将培养基pH值调至3.7～4.0后，高压灭菌。应注意的是，因为在较低的pH条件下，培养基中琼脂的交联度降低，难以形成固体培养基，所以要把琼脂与其它培养基成分分开灭菌，使用前再混合。由于常规果汁样品中，嗜酸耐热菌含量很少，因此多采用膜过滤法测定。取10克或10毫升果汁样品加入到90毫升灭菌水中，混匀，在80℃水浴中保持10分钟，以杀灭样品中其它不耐热菌，经0.45m膜过滤后，将过滤膜置于BSSA固体培养基上，45～50℃培养4天。对过滤膜上生长的菌落计数，即为10克（或10毫升）样品中嗜酸耐热菌菌数。

对于不适合过滤的浑浊样品，可使用BSSA液体培养基在50℃条件下增菌培养24小时，取1毫升增菌液于平皿中，加注BSSA固体培养基，于45～50℃培养4天，以判断样品是否为哨酸耐热菌阳性。在嗜酸耐热菌中，Alicyclobacillusacidoterrestfis（AAT）为果汁主要有害菌，如何鉴别AAT是十分重要的，日前四处使用的AAT快速诊断法有RT-PCR法、过氧化物酶法等方法。其中过氧化物酶法已形成商业试剂盒。

过氧化物酶论断的原理是：在培养基中添加vanillics酸，嗜酸耐热菌可使vanillics酸产生大量的愈创木酚，在过氧化氢存在的酸性条件下，愈创木酚在过氧化物酶作用下可产生棕色化合物四联愈创木酚。所以，可根据是否产生棕色合物来判断是否AAT阳性。诊断视AAT含量不同，可在3～5小时内完成。三、嗜酸耐热菌的来源及控制

嗜酸耐热菌广泛分布于世界各地，在多种酸性食品中都有存在。嗜酸耐热菌的根本来源为土壤，其在土壤中含量可达100cfu/g以上。水果表面及果树叶表面也存在有嗜酸耐热菌，但研究表明，雨后采摘的水果表面嗜酸耐热菌少于干燥季节采摘的水果，这可能是由于雨水冲刷，雨后水果表面灰尘少等原因造成的。果汁加工厂中嗜酸耐热菌的主要污染来自原料果本身，对水果充分冲洗是减少加工早期阶段菌数的有力措施。果汁加工的最初环节中，嗜酸耐热菌控制的关键在于冲洗水的质量和有效冲洗，因此应定期检测冲洗水中嗜酸耐热菌含量，确定洗果池中洗果水适宜的更换频率，延长流水喷淋时间，以确保冲洗干净。

果汁生产前期，加工温度较低，嗜酸耐热菌检出量较少，生产后期，加工温度升高，有利于嗜酸耐热菌的生长。过滤前果汁中的嗜酸耐热菌可以通过膜过滤去除。但有些企业往往在膜过滤后的产品中发现大量嗜酸耐热菌，这多是由于生产线管路污染造成的，因此必须控制好清洗用水的质量，加强加工生产线管路的清洗，采用适宜的清洗方法和清洗周期，以确保产品不发生嗜酸耐热菌的再次污染。对于浓缩果汁中嗜酸耐热菌的控制亦可采用瞬时高温灭菌，但应注意控制好灭菌温度和时间，不要影响产品的风味。

目前，国内浓缩果汁产品的国家推荐性标准中尚未对嗜酸耐热菌提出限量要求，有的企业为了应对不同客户的要求，要采用多种方法同时检测嗜酸耐热菌。我们希望能与各大果汁企业、检测机构联合，制订合理、实用的统一检测、控制方法，为企业降低检测成本，增强出口果汁产品的竞争力，也为国家加强进口果汁产品管理提供依据。