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4高效阴离子交换色谱 fC'u-m?!Q'
积分脉冲安培检测法(HPAEC2IPAD )是一种新的氨基酸分析方法。此方法是基于氨基酸分子中的羧基在强碱性介质中可以形成阴离子,而氨基酸分子中的氨基在强碱性介质中通过施加一定的电位,可在贵金属(金、铂)电极表面发生氧化反应,从而实现氨基酸的阴离子交换色谱分离和积分脉冲安培检测。1983年, Polta等[ 41 ]首先提出了用阴离子交换色谱2脉冲安培检测法分析氨基酸。其后,W elch等[ 42 ]对脉冲安培检测氨基酸和积分脉冲安培检测氨基酸进行了比较研究,提出了检测氨基酸的积分脉冲安培检测波形。以上研究工作虽然实现了氨基酸的直接分离检测,但由于存在基线漂移、线性、重现性差、电极损耗大以及无高效阴离子色谱柱分离氨基酸等问题,因此未能使氨基酸的分析达到可应用程度。Clarke等[ 43 ]得到了检测氨基酸的优化波形,采用高效阴离子交换柱,成功地实现了氨基酸的高效阴离子交换色谱分离和积分脉冲安培检测,并将此方法应用于蛋白质水解产物分析。HPAEC2IPAD分析氨基酸不需要对氨基酸进行衍生化处理,可直接进行分离、检测,对氨基酸的检出限为pmol～fmol级。由于糖类化合物(含有多羟基)在强碱性介质中可以形成阴离子并可用脉冲安培法检测,因此,用HPAEC2IPAD亦可分析糖类化合物、氨基糖和糖酸等。Yu等[ 44 ]对影响氨基酸分离和检测的因素进行了详细研究。这些因素包括淋洗液浓度、柱温和检测波形。通过实验得到了分离和检测19种氨基酸的最佳条件,并将这一条件应用于缬氨酸产品中微量氨基酸杂质的测定。Jandik等[ 45 ]采用二模式积分脉冲安培检测(即两种积分脉冲安培检测波形) ,对氨基酸和糖类化合物的混合物进行了分析。糖类化合物的检测电位比氨基酸的检测电位低,在较高的电位下,氨基酸和糖类化合物均被检测,而在较低的积分电位下只检测糖类化合物,氨基酸(羟基氨基酸除外)不被检测或检测信号很弱。这样,对氨基酸和糖类化合物的混合物可选择性地检测糖类化合物。这种二模式积分脉冲安培检测方法可用于氨基酸和糖的鉴定。 YA@?L!F
Yu等[ 46～48 ]详细研究了氨基酸和糖类化合物在阴离子交换柱中的保留行为和积分脉冲安培检测行为,提出了一次进样同时分析氨基酸和糖类化合物的方法,并将方法应用于液体调味品、黄酒和氨基酸注射液中氨基酸和糖类化合物的测定。D ing等[ 49 ]研究了绿茶中氨基酸和糖的分离测定,提出了一个改进的梯度淋洗程序,从而实现了绿茶中茶氨酸与谷氨酰胺的分离,并且葡萄糖、果糖和蔗糖先于中性氨基酸洗脱,避免了相互干扰。
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由于糖类化合物亦可用HPAEC2IPAD分离和检测,因此,大量糖类化合物的存在对氨基酸的测定有时会产生干扰。对于测定含有大量糖类化合物样品中的氨基酸, Jandik等[ 50 ]提出了一种简单的在线除糖测定氨基酸的方法。首先将样品通过一个短的氢型阳离子交换柱(捕获柱) ,由于在酸性条件下糖类化合物是以分子形式存在,而氨基酸以阳离子形式存在,因此,糖类化合物不被捕获柱保留,而氨基酸被捕获柱保留。其后,保留有氨基酸的捕获柱被切换到分析流路中与分离柱相连,流动相将捕获柱中的氨基酸带入分析柱,这样,在排除了糖干扰的情况下完成分离,并用于胡罗卜汁样品中氨基酸的测定。D ing等[ 51 ]提出了离线除糖测定氨基酸的方法。 Q(<A
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首先将样品中的糖通过氢型阳离子交换柱除去,然后测定氨基酸,并应用于果酒样品中氨基酸的测定,得到满意结果。与在线除糖方法相比,离线除糖方法的容量高,更适于含糖量高的样品中氨基酸的测定。用HPAEC2IPAD分离测定氨基酸时,精氨酸的保留时间很短,接近于死时间,这样影响了精氨酸的准确定量。为了增加精氨酸在阴离子交换柱中的保留时间, Jandik等[ 52 ]提出了通过阀切换方法将样品与硫酸同时进样,这样可利用阴离子交换柱中残存的阳离子交换基团增加精氨酸的保留。
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此项技术已用于大豆水解液和细胞培养基样品的分析。高效阳离子交换色谱2积分脉冲安培检测法亦可用于氨基酸的分析。Jandik等[ 53 ]用此方法测定了血浆中的高半胱氨酸和甲硫氨酸,所用工作电极为铂,流动相为0. 15 mol/L高氯酸钠、0. 02 mol/L高氯酸和5%乙腈。用积分脉冲安培法检测氨基酸时,存在金工作电极污染问题,而且尚无有效的清洗方法。为克服金电极的污染, Cheng等[ 54 ]研制了“可抛弃”金电极,用此电极分析氨基酸的结果与普通金电极一致。高效阴离子交换色谱2积分脉冲安培法可用于蛋白质水解液、食品、饲料等样品中氨基酸的测定。常用的蛋白质水解方法可与之相匹配。3种色谱法分析氨基酸的比较见表3。 5*2hTM!
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5其它分析技术
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有许多关于毛细管电泳技术(CE)分析氨基酸的报道[ 55～57 ]。此方法适合于氨基酸的手性分离。两第3期于泓等:氨基酸分析方法的研究进展104种CE模式用于氨基酸的分析。一种是毛细管区域电泳( CZE) ,另一种是胶束电动毛细管色谱(MECC)。与HPLC相比, CE的优点是分离效率高,无须梯度洗脱,分析速度快,溶剂消耗少。然而, CE分析的重现性较差。Sm ith[ 58, 59 ]总结了CE分析氨基酸的进展。柱前、柱上和柱后衍生技术,紫外、荧光、电化学、质谱等检测技术,均被用于分析氨基酸。在柱前衍生RP2HPLC分析氨基酸中所用的衍生试剂多数亦适用于CE法。氨基酸存在手性异构体(D型氨基酸和L型氨基酸) , CE是目前用于氨基酸手性分离报道较多的方法。W an等[ 60 ]对CE用于氨基酸的手性分离做了详细评述。氨基酸的手性拆分主要分为直接拆分和间接拆分两种方式。直接拆分是在加入手性选择性试剂的背景电解质溶液中分离氨基酸对映体,手性选择性试剂主要有环糊精类化合物、抗生素和表面活性剂等。间接拆分是利用手性衍生试剂将手性氨基酸转变为具有不同化学性质的衍生物,即手性消除,然后在非手性条件下进行分离。随着CE技术的发展,其在氨基酸及其手性异构体分析方面将起重要作用。 2n >mISy+
气相色谱( GC)用于测定衍生的氨基酸已有较长时间[ 61 ]。此方法的优点是分离时间短、柱效高及易与质谱联用;缺点是衍生反应干扰多、专一性差。目前此方法在氨基酸分析中应用不多。Gehrke等[ 62 ]比较了气相色谱与柱后衍生高效阳离子交换色谱分析氨基酸,发现二者的结果是相近的。Husek等[ 63 ]报道了用GC同时分析血浆中的20种氨基酸和30种非氨基有机酸,样品制备时间不足30 m in。GC/MS是一种强有力的分析方法,可测定氨基酸异构体[ 64 ]。高效液相色谱/质谱(HPLC /MS)和毛细管电泳/质谱(CE /MS)分析氨基酸是一种新趋势。Schmeer等[ 65 ]用液相色谱/大气压离子化质谱(LC /AP I2 MS)测定了D /L 2胱氨酸和半胱氨酸的PTC衍生物,得到了17种PTC2氨基酸和6种PTC2胱(半胱)氨酸的碎片。Ma等[ 66 ]用LC /AP I2 MS测定了鼠脑中的谷氨酸和γ2氨基丁酸。Pramanik等[ 67 ]用热喷雾LC /MS分析了氨基酸的PTC衍生物。Kwon等[ 68 ]用高效液相色谱/大气压微波等离子体离子化质谱(HPLC /AP2 M IP I2 MS)测定了非衍生化氨基酸。Qu等[ 69 ]用离子对反相液相色谱/同位素稀释串联质谱测定了人血液中的非衍生化氨基酸。王宗义等[ 70 ]用液相色谱/电喷雾离子化质谱(LC /ESI2 MS)分离鉴定了碘化酪蛋白水解产物中的碘化氨基酸。He[ 71 ]、Soga[ 72 ]、Schultz[ 73 ]等用毛细管电泳/电喷雾离子化质谱(CE /ESI2 MS)分析了非衍生化氨基酸。 kV sX/ ~$ br88b`L )xc1Lsrr9 文章出自: 世科网 9*j"@Rm 6$PQ$
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