一、样品信息
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样品组分 |
结构式 |
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柠檬黄 |
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新红 |
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苋菜红 |
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靛蓝 |
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胭脂红 |
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日落黄 |
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诱惑红 |
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亮蓝 |
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二．实验目的
参照《食品中合成着色剂的测定》（GB/T5009.35-2003），建立红酒中的合成着色剂的SPE-HPLC检测方法。
三．实验方法
3.1实验试剂
l 乙酸；
l 甲醇；
l 乙酸铵溶液（0.02mol/L）：称取1.54g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000mL；
l 氨水溶液：量取氨水2mL，加水至100mL，混匀；
l 甲醇/甲酸（6+4）溶液：量取甲醇60ml，甲酸40mL，混匀；
l 柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸，加水至100mL溶解，混匀；
l 无水乙醇-氨水溶液-水：量取无水乙醇70mL，氨水溶液20mL、水10mL，混匀；
l 水（PH=6.0）：水加柠檬酸溶液调节PH=6.0；
l 水（PH=4.0）：水加柠檬酸溶液调节PH=4.0；
l 水：超纯水
l 合成着色剂储备液：每1.0mL中含柠檬黄、新红、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝各0.5mg，诱惑红0.1mg的水溶液；
l 合成着色剂使用液：上述合成着色剂储备液逐级稀释成每1.0mL中含柠檬黄、新红、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝各5μg，诱惑红1μg的水溶液；
l Cleanert® JXA SPE小柱：规格为1g/6mL，使用前经5mL甲醇和5mL pH=6.0的水活化。
3.2.实验耗材
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名称
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规格
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订货号
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Venusil® XBP C18
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5μm，100A，4.6*150mm
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VX951505-0
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保护柱芯
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4.6*10mm，4/pk
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VX950105-0
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保护柱套
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适用于4.6*10mm的保护柱芯
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CH-100
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Cleanert® JXA
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1g/6mL，30/盒
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JXA0006
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Hydrophilic PTFE
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0.45um，13mm，100/包
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AS081345
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3.3.试样处理
取试样（某品牌红酒）20mL,加入合成着色剂混标溶液1.0mL，混匀，用10%氨水调节PH约6.0，将全部试样经过Cleanert® JXA柱，分别用水（PH=4.0）、甲醇/加酸（6+4）溶液6ml淋洗，再用10mL水淋洗，用乙醇-氨水溶液-水（7+2+1）6mL洗脱，收集洗脱液于50℃水浴蒸发至干，加水定容至1.0mL，经0.45μm滤膜过滤，待测。
3.4液相色谱条件
色谱柱：Venusil® XBP C18，5μm；4.6*150mm；
流动相：A：0.02mol/L的乙酸铵溶液（乙酸调节pH=4）；
B：甲醇
流 速：1.0mL/min；
进样量：20μL；
波 长：254nm；
梯 度：
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时间
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A%
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B%
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0
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95
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5
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10
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80
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20
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18
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40
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60
|
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25
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40
|
60
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25.01
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95
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5
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|
40
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95
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5
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四．实验结果
表1.添加5ppm混标峰面积数据
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样品组分
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标品
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标样过柱1
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标样过柱2
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红酒样品1
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红酒样品2
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柠檬黄
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318
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320
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315
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294
|
324
|
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新红
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471
|
474
|
461
|
482
|
473
|
|
苋菜红
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266
|
269
|
262
|
277
|
279
|
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靛蓝
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314
|
282
|
279
|
273
|
275
|
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胭脂红
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266
|
267
|
263
|
246
|
240
|
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日落黄
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234
|
238
|
234
|
210
|
212
|
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诱惑红
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33
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33
|
33
|
35
|
34
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亮蓝
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39
|
40
|
39
|
37
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37
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表2.添加5ppm混标回收率数据
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样品组分
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标样过柱1（%）
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标样过柱2（%）
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红酒样品1（%）
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红酒样品2（%）
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柠檬黄
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100.6
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99
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92.5
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102
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新红
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100.6
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97.8
|
102
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100
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苋菜红
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101
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98.5
|
104
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105
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靛蓝
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89.8
|
88.8
|
86.9
|
87.5
|
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胭脂红
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100.3
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98.8
|
92.5
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90.2
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日落黄
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101
|
100
|
90
|
90.6
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诱惑红
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100
|
100
|
106
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103
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亮蓝
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102
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100
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95
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95
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五、实验结论
实验结果表明，Cleanert® JXA小柱和Venusil® XBP C18液相色谱柱可以用于红酒中的合成着色剂的检测，该方法快速、准确。
六、注意事项
l 红酒样品呈弱酸性，在上样之前要将其pH值调节至6左右，保证小柱可对合成着色剂有良好地吸附；
l 若样品酒精度过高，建议在上样前对样品进行除醇处理；
l SPE小柱净化过程中，要注意对流速的控制，建议控制在1mL/min左右；
l 洗脱液氮吹复溶后，应选用水系滤膜过滤，防止因滤膜吸附造成样品的损失，建议选用Agela Hydrophilic PTFE滤头。
附录：
图1 5ppm混标溶液
图2 5ppm混标过柱1
图3 5ppm混标过柱2
图4 红酒空白图谱
图5 5ppm基质加标1
图6 5ppm基质加标2