摘要：建立了固相萃取-液质联用对化妆品中泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、倍他米松、地塞米松等11种糖皮质激素同时检测的方法。化妆品样品用乙腈提取后，经Cleanert®PEP-2 SPE固相萃取柱配合卓睿TM全自动固相萃取仪净化后，使用Venusil®ASB C18色谱柱，经有液相的API 4000 PLUS三重四级杆质谱仪进行定量分析。在高低添加水平下，11种糖皮质激素的平均回收率为75%-120%；相对标准偏差均小于13% 。
关键词：糖皮质激素；化妆品；固相萃取；液质联用
糖皮质激素是临床常用的一类药物，对皮肤病有良好的消炎作用，可抑制纤维细胞增生，减少5-羟色胺的形成，因此其在短时间使用对皮肤有一定的嫩白作用【1】。但长期使用则会发生皮肤变薄、毛细血管扩张、毛囊萎缩，一旦停用，皮肤就会发红、发痒，出现红斑、皮疹等。因此我国《化妆品卫生规范》【2】明确规定此类物质为禁用成分。目前糖皮质激素的检测多集中在药品中有效成分和尿液中糖皮质激素的检测【3-4】，化妆品中糖皮质激素的检测文献报道的较少。本文采用Cleanert® PEP-2 SPE配合卓睿全自动固相萃取仪净化的方法，建立了一种化妆品中泼尼松、泼尼松龙、可的松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、醋酸可的松、醋酸泼尼松、醋酸氢化可的松、曲安奈德11种糖皮质激素同时检测的方法。
一．实验方法
1.1.实验试剂和材料
1.1.1糖皮质激素类药物标准品（详见表1）
表1 糖皮质激素类药物标准品信息
|
中文名
|
英文名
|
CAS号
|
相对分子质量
|
|
泼尼松龙
|
PrednISOne
|
50-24-8
|
360.1937
|
|
氢化可的松
|
Hydrocortisone
|
50-23-7
|
362.2093
|
|
泼尼松
|
Prednisone
|
53-03-2
|
358.1780
|
|
可的松
|
Cortisone
|
53-06-5
|
360.1937
|
|
甲基泼尼松龙
|
Methylprednisolone
|
83-43-2
|
374.2093
|
|
倍他米松
|
Betamethasone
|
378-44-9
|
392.1999
|
|
地塞米松
|
Dexamethasone
|
50-02-2
|
392.1999
|
|
曲安奈德
|
Triamcinolone acetonide
|
76-25-5
|
434.2105
|
|
氢化可的松醋酸酯
|
Hydrocortisone 21-acetate
|
50-03-3
|
404.2200
|
|
泼尼松醋酸酯
|
Prednisone 21-acetate
|
125-10-0
|
400.1886
|
|
可的松醋酸酯
|
Cortisone 21-acetate
|
50-04-4
|
402.2042
|
1.1.2实验试剂（详见表2）
表2 实验试剂
|
试剂名称
|
品牌
|
规格
|
|
甲醇
|
天津博纳艾杰尔科技
|
质谱纯，2.5L/瓶
|
|
乙腈
|
天津博纳艾杰尔科技
|
质谱纯，2.5L/瓶
|
|
水
|
天津博纳艾杰尔科技
|
质谱纯，2.5L/瓶
|
1.1.3仪器和设备（详见表3）
表3 实验用仪器和设备
|
设备名称
|
品牌
|
规格/型号
|
|
串联质谱仪
|
AB SCIEX
|
API 4000+
|
|
高效液相色谱仪
|
安捷伦
|
1260
|
|
Venusil® ASB C18液相色谱柱
|
天津博纳艾杰尔科技
|
2.1×150mm 3µm 150Å
|
|
分析型柱温箱
|
天津博纳艾杰尔科技
|
>室温5℃~70℃
|
|
卓睿全自动固相萃取仪
|
天津博纳艾杰尔科技
|
SPE-40
|
|
Cleanert® PEP-2 固相萃取小柱
|
天津博纳艾杰尔科技
|
150mg/6mL
|
|
针孔过滤器（尼龙）
|
天津博纳艾杰尔科技
|
0.22um，13mm
|
|
分析天平
|
赛多利斯
|
0.1mg，220g
|
|
高速离心机
|
上海华亭
|
50mL*6
|
|
涡旋振荡器
|
Vortex-genie
|
230/240VAC 50HZ
|
|
氮吹仪
|
天津博纳艾杰尔科技
|
15位
|
1.2.糖皮质激素类药物标准溶液配制
1.2.1标准贮备液
分别精密称取适量的11种糖皮质激素标准品，用甲醇溶解定容，分别配制成1000μg/mL的贮备液。
-20℃以下保存。
1.2.2混合标准工作液
准确量取糖皮质激素类药物标准贮备液适量，用20%乙腈水溶液稀释成适宜浓度的混合标准工作液。
现配现用。
1.3.实验试剂的配置
1.3.1 10%亚铁氰化钾溶液：称量2.3g K4Fe(CN)6•3H2O，用水溶解定容至20mL；
1.3.2 20%乙酸锌溶液：称量4.78g C4H6O4Zn•2H2O，用水溶解定容至20mL；
1.3.3定容液：量取70mL水和30mL乙腈，混匀后加入100µL甲酸混匀。
1.4.测定步骤
1.4.1提取
霜膏类化妆品：称取0.2g试样（精确至0.01g）于50mL离心管，混匀。加入3mL饱和氯化钠溶液，涡旋混合使样品分散，加入3mL乙腈，超声提取5min，8000r/min离心5min，吸取上层清液于另一50mL离心管中，下层氯化钠溶液用2mL乙腈重复提取一次，合并二次乙腈提取液，往提取液加入40mL去离子水，混匀，加入亚铁氰化钾溶液0.2mL，混匀，加入乙酸锌溶液0.2mL，混匀，8000r/min离心10min，作为待进化液。
精油类样品：称取0.5g试样（精确至0.01g）于50mL离心管，混匀。加入4mL正己烷，涡旋混合使样品分散，加入4mL50%乙腈水溶液，涡旋提取2min，8000r/min离心5min，吸取下层提取液，上层正己烷用4mL50%乙腈水溶液重复上述提取步骤一次，合并二次50%乙腈提取液，往提取液加入36mL去离子水，混合，加入亚铁氰化钾溶液0.1mL，混匀，加入乙酸锌溶液0.1mL，混匀，8000r/min离心10min，作为待进化液。
1.4.2净化
将PEP-2固相萃取小柱置于卓睿全自动固相萃取仪，上样液转移至上样管中，溶剂置于相应的溶剂瓶中，设定操作程序如下：用5mL甲醇、10mL水活化。将上样管中溶液全部上样，然后以10mL10%乙腈水溶液淋洗小柱，待清洗液自然流尽后，通气吹干小柱中的残留液（5min）。最后以6mL甲醇洗脱小柱，待甲醇自然流尽后，通气吹干小柱中的残留液（5min），以上操作流速均设定为1mL/min。取出收集瓶，于40℃氮气吹干，用1mL定容液溶解定容，过0.22µm尼龙滤膜，待测。
1.4.3测定
1.4.3.1液相色谱条件
色谱柱：Venusil® ASB C18 3μm 150Å 2.1*150mm；柱温：30℃；进样量：10μL。
流动相：A相：含0.1%甲酸的水溶液；B相：含0.1%甲酸的乙腈溶液；
梯度洗脱程序见表4
表4 流动相梯度洗脱条件和流速
|
时间min
|
流速μL/min
|
A相%
|
B相%
|
|
0.00
|
200
|
68
|
32
|
|
3.00
|
200
|
68
|
32
|
|
10.00
|
200
|
25
|
75
|
|
15.00
|
200
|
15
|
85
|
|
15.01
|
200
|
68
|
32
|
|
25.00
|
200
|
68
|
32
|
1.4.3.2质谱条件
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；
IS：-4500V；GS1：55Psi；GS2：55Psi；TEM：550℃；
糖皮质激素类药物多反应监测的优化参数见表5
表5 糖皮质激素类药物多反应监测的优化参数
|
药物名称
|
保留时间/min
|
监测离子对
|
DP
|
EP
|
CE
|
CXP
|
|
泼尼松龙
|
6.22
|
405.1/329.1
|
-40
|
-10
|
-20
|
-9
|
|
405.1/359.2
|
-40
|
-10
|
-20
|
-9
|
||
|
氢化可的松
|
6.35
|
407.2/331.1
|
-30
|
-10
|
-22
|
-9
|
|
407.2/361.1
|
-30
|
-10
|
-22
|
-9
|
||
|
泼尼松
|
6.29
|
403.1/326.9
|
-50
|
-10
|
-18
|
-9
|
|
403.1/357.2
|
-50
|
-10
|
-18
|
-9
|
||
|
可的松
|
6.66
|
405.1/329.1
|
-40
|
-10
|
-20
|
-9
|
|
405.1/359.2
|
-40
|
-10
|
-20
|
-9
|
||
|
甲基泼尼松龙
|
9.02
|
419.2/343.0
|
-40
|
-10
|
-22
|
-9
|
|
419.2/373.0
|
-40
|
-10
|
-22
|
-9
|
||
|
倍他米松
|
9.55
|
437.2/361.3
|
-60
|
-10
|
-22
|
-1
|
|
437.2/391.1
|
-65
|
-10
|
-22
|
-1
|
||
|
地塞米松
|
10.04
|
437.2/361.3
|
-60
|
-10
|
-22
|
-1
|
|
437.2/391.1
|
-65
|
-10
|
-22
|
-1
|
||
|
曲安奈德
|
12.22
|
479.1/413.4
|
-60
|
-10
|
-24
|
-11
|
|
479.1/337.1
|
-40
|
-10
|
-24
|
-11
|
||
|
氢化可的松醋酸酯
|
12.9
|
449.2/403.0
|
-50
|
-10
|
-16
|
-11
|
|
449.2/373.0
|
-50
|
-10
|
-16
|
-11
|
||
|
泼尼松醋酸酯
|
13.42
|
447.2/401.1
|
-45
|
-10
|
-18
|
-9
|
|
447.2/371.2
|
-50
|
-10
|
-18
|
-9
|
||
|
可的松醋酸酯
|
12.30
|
445.2/339.1
|
-40
|
-10
|
-16
|
-9
|
|
445.2/369.3
|
-45
|
-10
|
-16
|
-9
|
注：带“____”的监测离子对为定量离子对。
二．结果与讨论
2.1.净化条件的选择
目前文献报道的净化方法多选用聚合物基质的吸附性材料或硅胶基质的ODS SPE小柱。本文选用Cleanert® PEP-2 SPE小柱，实验结果表明其可同时对11种糖皮质激素有很好的吸附。
考察了不同体积分数0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%乙腈的水溶液的洗脱效果，结果表明使用10%乙腈的水溶液，可保证11种糖皮质激素不被洗脱下来，所以最终选用10%乙腈的水溶液做淋洗液，并且在上样之前要用水将乙腈的提取液稀释。
卓睿全自动固相萃取仪的使用，大大提高样品前处理的效率，同时减少人为操作的误差，保证结果的重现性。
2.2.液相色谱柱的选择
在本文要同时检测的11种糖皮质激素中，可的松和氢化可的松、倍他米松和地塞米松为同分异构体，在反相液相色谱中比较难分离。通过比较不同C18的分离效果，最终选用Venusil® ASB C18（3µm，150Å，2.1×150mm）为色谱柱，可保证11种糖皮质激素在15min内均达到基线分离。
2.3.准确度和重现性
以市售玫瑰精油和护手霜为基质，进行添加回收实验，进行0.1μg/g和0.05μg/g添加浓度的实验，11种糖皮质激素的回收率均在75%-120%之间，具体实验结果请见下列表格：
表6 玫瑰精油0.1µg/g添加回收实验结果
|
药物名称
|
平行1
|
平行2
|
平行3
|
平均回收率
|
RSD
|
|
泼尼松
|
85.19%
|
85.65%
|
76.98%
|
82.61%
|
5.90%
|
|
泼尼松龙
|
91.68%
|
90.70%
|
81.07%
|
87.82%
|
6.68%
|
|
可的松
|
93.67%
|
92.11%
|
82.38%
|
89.39%
|
6.84%
|
|
氢化可的松
|
84.56%
|
89.38%
|
86.89%
|
86.94%
|
2.77%
|
|
甲基泼尼松龙
|
94.08%
|
82.90%
|
84.75%
|
87.24%
|
6.87%
|
|
倍他米松
|
89.74%
|
90.28%
|
80.51%
|
86.84%
|
6.33%
|
|
地塞米松
|
103.10%
|
93.90%
|
89.10%
|
95.37%
|
7.46%
|
|
可的松醋酸酯
|
87.19%
|
87.40%
|
92.02%
|
88.87%
|
3.07%
|
|
泼尼松醋酸酯
|
119.07%
|
119.86%
|
111.63%
|
116.85%
|
3.89%
|
|
氢化可的松醋酸酯
|
91.12%
|
91.69%
|
87.43%
|
90.08%
|
2.57%
|
|
曲安奈德
|
98.72%
|
84.57%
|
87.15%
|
90.14%
|
8.36%
|
表7玫瑰精油0.05µg/g添加回收实验结果
|
药物名称
|
平行1
|
平行2
|
平行3
|
平均回收率
|
RSD
|
|
泼尼松
|
78.32%
|
75.44%
|
86.69%
|
80.15%
|
7.29%
|
|
泼尼松龙
|
85.75%
|
85.75%
|
86.16%
|
85.88%
|
0.28%
|
|
可的松
|
86.99%
|
77.29%
|
88.46%
|
84.25%
|
7.20%
|
|
氢化可的松
|
72.36%
|
69.15%
|
75.04%
|
72.18%
|
4.08%
|
|
甲基泼尼松龙
|
84.80%
|
88.74%
|
99.95%
|
91.16%
|
8.62%
|
|
倍他米松
|
76.19%
|
85.32%
|
95.32%
|
85.61%
|
11.18%
|
|
地塞米松
|
80.38%
|
79.99%
|
90.64%
|
83.67%
|
7.22%
|
|
醋酸酯可的松
|
86.52%
|
93.17%
|
107.36%
|
95.68%
|
11.13%
|
|
泼尼松醋酸酯
|
119.39%
|
107.72%
|
111.49%
|
112.87%
|
5.28%
|
|
氢化可的松醋酸酯
|
94.54%
|
110.02%
|
103.75%
|
102.77%
|
7.58%
|
|
曲安奈德
|
94.10%
|
73.98%
|
90.74%
|
86.27%
|
12.49%
|
表8护手霜0.1µg/g添加回收实验结果
|
药物名称
|
平行1
|
平行2
|
平行3
|
平均回收率
|
RSD
|
|
泼尼松
|
98.47%
|
96.35%
|
87.64%
|
94.16%
|
6.09%
|
|
泼尼松龙
|
104.71%
|
106.49%
|
100.10%
|
103.76%
|
3.18%
|
|
可的松
|
99.64%
|
93.01%
|
97.16%
|
96.60%
|
3.47%
|
|
氢化可的松
|
91.60%
|
90.07%
|
95.88%
|
92.51%
|
3.26%
|
|
甲基泼尼松龙
|
107.41%
|
102.56%
|
101.39%
|
103.79%
|
3.07%
|
|
倍他米松
|
105.77%
|
100.40%
|
105.90%
|
104.02%
|
3.02%
|
|
地塞米松
|
99.96%
|
97.00%
|
100.11%
|
99.02%
|
1.77%
|
|
可的松醋酸酯
|
124.48%
|
119.24%
|
111.62%
|
118.44%
|
5.46%
|
|
泼尼松醋酸酯
|
104.31%
|
93.72%
|
90.30%
|
96.11%
|
7.60%
|
|
氢化可的松醋酸酯
|
103.96%
|
114.47%
|
114.17%
|
110.86%
|
5.40%
|
|
曲安奈德
|
94.97%
|
111.77%
|
93.30%
|
100.01%
|
10.22%
|
三．实验结论
使用Cleanert® PEP-2、Venusil® ASB C18建立了一种化妆品中11种糖皮质激素同时检测的分析方法，实验结果表明本方法快速、准确，可用于化妆品中糖皮质激素的检测。
参考文献
【2】化妆品卫生规范。2007.34
【3】左志辉，周建玉，左文坚。药物分析杂志。2004,24（4）：420
附图
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