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[抗生素]水产品中氯霉素残留测定方法概述 [复制链接]

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Analysis of determination methods of chloramphenicol residues in aquatic products n@;B_Bt7  
tAJ}36 aG  
    氯霉素(Chloramphenicol,CAP),是一种有效的广谱抗生素,常用于动物各种传染性疾病的治疗,对多种病原菌有较强的抑制作用,曾在水产养殖业中得到广泛应用,同时也带来了水产品氯霉素残留的严重
问题。氯霉素存在严重的毒副作用,能抑制人体骨髓造血功能,引起人类的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿、早产儿灰色综合症等疾病,低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性,因此动物食品中的氯霉素残留对人类的健康构成了巨大威胁(蒋定国 2002;胡顶飞 2001)。 A b j7  
5*YvgB;  
    氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。
欧盟美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零容许量”(Zero tolerance)(Georage 2002),即不得检出。我国是一个水产养殖大国,养殖规模不断扩大,但养殖过程中滥用抗生素,已成为一个严重的水产品安全问题。自去年以来,我国出口水产品频频被进口国检出氯霉素残留。去年9月底,欧盟因氯霉素残留问题将中国产冻虾产品纳入其食品快速预警机制,又于今年初通过决议,自2月1日起全面暂停从中国进口动物制品;2002年1月,美国FDA也对我国虾产品发出预警通报;3月中旬,日本厚生省宣布对我国动物产品实施严格检查,并公布了包括氯霉素在内的11种药物的残留限量。今年1到6月,我国水产品对欧盟出口量、出口额比去年同期分别下降70.8%和73%。药物残留已成为扩大水产品国际贸易的主要障碍。针对这种情况,农业部已将氯霉素从2000年《中国兽药典》中删除,此药重新进入安全评价体系,在《动物性食品兽药残留规定》中规定可食部分不得检出,并且在出口的日常检测中,将其列为必检项目,一旦发现超标,一律禁止出口。 [' pO=ho  
m&xVlS  
    对于氯霉素残留,由于存在多种检测方法,因此各种方法的检出限问题已成为关注的焦点。发达国家对检出限的要求越来越严格。欧盟由原来的10 μg/kg改为1 μg/kg,继而又降至0.1 μg/kg,比原标准要求提高了100倍;美国FDA规定的检出限也由原来的5 μg/kg改为1 μg/kg,即将降为0.3 μg/kg,且目前正在研究应用更为灵敏的方法,可使检出限值达0.1 μg/kg。水产品中氯霉素残留检测方法的检出限已在国际贸易合作中成为新的技术性壁垒。 /w5*R5B{  
hf2bM `d  
    为保障食用者的健康,应对技术壁垒,在全球性贸易竞争中立于不败之地,必须加强水产品中的药物残留监控检测工作,氯霉素即为其中的热点之一。近年来各种关于氯霉素残留的检测方法不断涌现,大致可分为三大类:第一类是生物测定法,第二类是化学分析法,第三类是兼有生物和化学的酶联免疫检测法。 c6c@ Xd V  
JJbd h \  
    本文结合国内外的报道,对几种常用的氯霉素残留检测方法做了概括性叙述,并对其特点及检出限进行了分析比较。 =MJB:  
   Q{950$ )L  
1 筛选检验方法 $rr@3H+  
   '&Y_ ,-i  
    在实际工作中,不可能也无必要对所有动物性水产品进行各种复杂、昂贵耗时的分析检测,为能快速确定动物食品中是否有氯霉素残留,通常做法是遵循一定程序,对被测产品进行取样,按规范要求对样品进行筛选检验(Screening method),对筛选为阳性的样品再用更精确的方法进行定量鉴定。 {xov8 M  
   /PTRe5-7  
1.1 微生物法 z5M6  
vFntzN>#  
     在快速筛选检验程序中,微生物法非常有效,这类方法简单、费用少、速度快,因而广泛用于动物性食品兽药残留的初筛。 +D]raU  
`=#jWZ.8m  
1.1.1 棉签法 ml1%C%  
     棉签法(Swab test on premises,STOP),又称现场拭子法,是检测动物体中抗生素残留的现场试验方法。本法自1979年由美国农业部食品安全和检验署研究开发出以后,世界各国都普遍采用,目前在加拿大和美国,试剂已商品化,有药盒形式的商品出售(李诚 1993)。 Y01! D"{\  
7G-?^  
    该方法是用棉签(拭子)采取动物体内的组织液,然后将其放置于涂满枯草杆菌的培养基中保温过夜。观察是否在拭子周围出现抑菌环,若有,即表明组织液中有抗生素存在。如果该动物仅用氯霉素进行过治疗,则可以认为该组织中存在氯霉素残留。梅先之(1997)用该法对鲤鱼体内氯霉素残留进行了研究。 他采用枯草芽孢杆菌菌株配制芽孢悬浮液。将切碎鱼肉与不同浓度氯霉素标准液混合,用上述方法检测是否形成抑菌圈,结果表明最低检出限为1.00 μg/g。 G(#t,}S}@  
 ]gcOMC  
    此方法在几分钟内即可完成取样操作,16~18 h即可获得结果,是简便易行而又有一定准确性的检测方法,比较适合基层现场筛选检测(宋华宾 1993)。但是该检测法灵敏度较差,检出限较高,多在μg/g级,特异性差,一般抗生素类药物都有此类反应,而且不能定量。 `}=R  
`DgK$QM  
1.1.2 杯碟法 Z*mbhod  
wxh\CBxG  
    样品经处理后,注入牛津杯中,与含菌液的检定平板贴合,培养后,根据抑菌圈有无及大小判定结果。采用不同的试验菌种,可检测不同的抗生素(宋华宾 1993)。 [F+W]Jk,  
     焦彦朝(2000)用此法研究了鲤鱼体内氯霉素残留。向均匀切碎的鱼肉中加入适量氯霉素标准溶液(不含土霉素),37 ℃培养基平衡1 h,加入乙酸乙酯,匀浆后离心,取上清液,70 ℃减压浓缩,浓缩物中加入含土霉素的磷酸缓冲液,涡旋振荡后,45 ℃水浴放置30 min,过滤,滤液备用。用标准曲线的回归方程计算氯霉素效价,与应有效价相比,以超出50%的回收率为最低检出限。另外,在样品处理过程中分别加入青霉素、土霉素以消除干扰影响。研究表明,此法检出限为0.25 μg/g;氯霉素浓度在0.25~1.00 μg/g时回收率范围在66%~69.2%之间,平均回收率为67.5%;而且排除了青霉素、土霉素的干扰。 *1 `X}  
=ejU(1 g  
    这种方法与棉签法相比,灵敏度高,能够排除一定的干扰,但是,要进一步提高灵敏度很困难。 a!:N C  
<O'U-. Gc  
#c@&mus  
1.1.3 其他方法 1a{3k#}  
~>=.^  
    其它微生物法还包括纸片法、琼脂扩散法、TTC法、BBRT法等,这些方法都存在灵敏度低的缺点。 Bgc ]t  
   YWH>tt 9  
    微生物法易受组织中其它抗生素的影响,特异性低,灵敏度也不高,但操作简便,样品用量少,预处理简单,在基层大规模筛选工作中有很大的应用价值。 3jxC}xz)  
   P1LO j  
1.2 免疫分析方法(IA) [%dsq`b#  
   \~%+)a%%  
    免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的新型分析技术。免疫反应具有很高的选择性和灵敏性,因此,免疫分析技术无论作为兽药残留分析的检测手段还是样本净化方法都能使分析过程特别是前处理步骤大大简化。作为相对独立的检测方法,即基于竞争结合分析原理的免疫测定法,包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、固相免疫传感器等(谢恺舟 2001)。 23^>#b7st  
     目前使用最普遍的酶联免疫法(ELISA),具有操作简便、灵敏度高、样品容量大、仪器化程度和分析成本低的优点,是目前最理想的残留筛选性分析方法之一。 'A:Y&w"r  
     ELISA是基于抗原和抗体反应而建立的。由于氯霉素是半抗原,不能刺激机体产生抗体。要使半抗原性物质具有免疫原性,就需使其与大分子载体物质(蛋白质)相结合制备人工抗原,而后将其作为抗原进行使用,动物体内即可产生相应特异性的抗氯霉素的抗体。在此基础上建立酶联免疫竞争法测定氯霉素含量(刘智宏 1995)。 -GPBX?  
     以德国R-Biopharm公司制造的酶联免疫分析定量检测氯霉素残留试剂盒为例,其微孔板包被有针对兔IgG(氯霉素抗体)的羊抗体。加入氯霉素抗体,氯霉素酶标记物,氯霉素标准或样品溶液。游离氯霉素与氯霉素酶标记物竞争氯霉素抗体结合位点(竞争性酶免疫分析),同时氯霉素抗体也与固定的羊抗体结合。没有结合的氯霉素酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质(过氧化脲)和发色剂(四甲基联苯胺)加入到孔中并且孵育。结合的氯霉素酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色产物。加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450 nm处测量。吸光度值与样品中的氯霉素浓度成反比。在对虾或鱼肉样品的检测中,此种方法灵敏度高,检测下限可达0.05 μg/kg,重现性好,回收率高,在1 μg/kg的添加水平下,回收率可达107%~113%。 @L!^2v  
     酶联免疫法的缺点在于影响因素较多,易出现大量假阳性结果。抗体批次不同,测定结果也会出现差异。 X<;.  
K)Lo Z^x0)  
1.3 CHARM II '1b 1N5~  
ch0^g8@Q[  
    CHARM II检测氯霉素残留试剂盒为美国FDA推荐使用的检测仪器,是由美国CHARM Science公司研制生产的第二代产品。CHARM公司是一家运用现代生物技术研制快速检测方法的跨国公司,生产的抗生素测试仪现被6个美国FDA实验室、55个州立实验室和7个美军基地作为标准仪器使用;同时美国AOAC也采用CHARM II作为标准检测工具。美国要求用快速检测方法检测后要验证确认,如用CHARM II法则不须验证,但需要多个实验室的检测评价。 6J,h}S  
q\o#<'F1J  
    此法的基本原理是:将免疫抗体溶于水后,加入含氯霉素的样品中,在一定的孵育温度下,样品中的氯霉素与受体位点结合,再加入[3H]标记的氯霉素抗原与多余的受体位点结合,孵育一段时间后离心沉淀,取沉淀物加闪烁液,用闪烁计数仪(CHARM II分析仪)测定荧光强度,样品中氯霉素残留量与荧光强度成反比。对于鱼组织中氯霉素残留量的检出限可达0.15 μg/kg,但同样存在假阳性结果的问题。
J2VPO n  
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2 定量确认方法 ;8PO}{rD  
?l%4 P5  
2.1 高效液相色谱法 }&/>v' G  
z<9C-  
    高效液相色谱法检测氯霉素是一种灵敏度较高、可靠性较强的一种方法,此法重复性好、假阳性少,可以进行定量鉴定,但检出限较高,为5~10 μg/kg,回收率偏低。因为动物体内成分复杂,一些杂质干扰测定,应用该法检测时,对于样品预处理必须仔细谨慎,以提高测定准确性和灵敏度。 P6kD tUXF  
+pG+ xI  
    Keukens等(1986)报道了用高效液相色谱法筛选和确证在可食用的动物组织中的氯霉素残留。筛选方法是将试样用蒸馏水提取,提取液通过Extrelut柱(Merck 11737),二氯甲烷洗脱,氮气吹干,用水溶解残留物并与甲苯分配,水相用于色谱分析。检出限为5 μg/kg,添加水平为10 μg/kg时的回收率为58%。确证方法:用乙酸钠缓冲液提取,加入葡糖苷酸酶和芳基磺酸酶于37 ℃孵育16 h,再加入200 mL乙酸乙酯和20 g氯化钾,将有机相浓缩后溶于二氯甲烷-石油醚(1﹕1),通过硅胶Sep-Pak柱,用石油醚以及乙酸乙酯-正己烷(1﹕1)洗涤层析柱,然后用乙酸乙酯-正己烷(7﹕3)洗脱,将洗脱液浓缩后溶于Tris缓冲液(pH 10.4),乙醚萃取氯霉素,浓缩后溶于水和甲苯,水相用于色谱分析。该方法能确证10 μg/kg以上的氯霉素残留,回收率为85%。 P^"RH&ZQJ  
v|~=rvXFC  
    Nagata等(1992)报道了用液相色谱法同时测定动物肌肉和养殖鱼肌肉中的甲砜氯霉素和氯霉素残留方法。试样用乙酸乙酯提取,提取液浓缩至干,将残留物溶于3%氯化钠溶液,正己烷脱脂,水相用乙酸乙酯萃取,浓缩干乙酸乙酯后用正己烷溶解,过Sep-Pak Florisil柱净化后,用ODS柱分离,225 nm或270 nm检测,当氯霉素为0.1 μg /g时平均回收率大于74.1%,检出限量为10 μg/kg。 rM.Pc?Z  
TO89;O  
    比利时的Degroodt J.M.(1992)用HPLC及碘斯特光阵研究检测了鱼中氯霉素和硝基呋喃的残留。氯霉素用乙酸乙酯提取,提取液经石油醚和n-戊烷纯化,然后用HPLC及光阵检测器(Photodiode array detector)于280 nm处检测。样品回收率在69%~88%之间,研究表明,检出限可达2 μg/kg。 # &)H&H}  
?&9=f\/P  
    王秉栋(1991)报道了动物性食品中氯霉素残留测定的高效液相色谱法。试样处理:将试样用一定量的无水硫酸钠研成干粉状,加1 mol/L乙酸钠缓冲液20 ml、乙酸乙酯10 ml,振荡提取,过滤,残渣用乙酸钠缓冲液洗涤,并入提取液,分出有机层,水相用乙酸乙酯萃取两次,提取液再用饱和氯化钠洗涤两次,乙酸乙酯浓缩后,用10 ml 20%乙腈水溶液溶解,再用20 ml石油醚脱脂,水层用于分析。色谱条件:Hypersil H5 ODS柱,10 cm×4 mm,流动相为水-乙腈-1 mol/L乙酸钠缓冲液(80﹕20﹕1),检测波长280 nm。 tf7HhOCYX  
<eMqg u  
    李兰生(1997)等用高效液相色谱法检测了对虾体内氯霉素的残留量,并进行了氯霉素在对虾体内的动力学研究。试样制备:对虾组织中加入与试样等量的蒸馏水,匀浆,加入4倍量甲醇,振摇提取,离心后上清液分析。分离条件:μ-Bondapak C18柱,流动相为甲醇-水(30﹕70),在氯霉素添加浓度为2.5 mg/kg时的回收率为91.2%。 !;8Y?c-D  
.gfi9J  
2.2 气相色谱法  Mj1f;$  
   s"#N;  
    气相色谱法的特点是高分离效能、高选择性、高灵敏度、快速,应用广,还可用于制备高纯物质。它可以对于分配系数相差很近的组分进行分离,从而分离出极为复杂的混合物。检出限低,有许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器供选用,如氢焰离子化检测器(FID)、电子捕获检测器(ECD)、氮磷检测器(NPD)等,检出限一般为μg/kg级,常用于抗生素药物残留的检测。但是大多数兽药极性或沸点偏高,需繁琐的衍生化步聚,因而限制了GC的应用(李俊锁 1997)。 :|kO}NGM  
'kj q C  
    气相色谱检测法中最为灵敏的方法是1974年10月AOAC年会上由Jacobson等人提出的(Jacobson 1974)。该方法用乙酸乙酯提取动物组织中的药物,用含4% NaCl溶液的正己烷去除脂类物质,通过硅藻土色谱柱提纯净化,加入四甲基硅烷(TMS)衍生化,最后进样检测。肌肉样品的回收率大于80%,检出限低于1 μg/kg。色谱条件:电子捕获检测器(ECD),Gas-Chrom Q色谱柱(含有4% Se-30),流动相为氩-甲醇(95﹕5)。 *~ IHVU  
Drtg7v{@\  
    王建华(2001)研究报道了同时测定鱼肉中氯霉素和甲砜霉素残留量的毛细管气相色谱法。样品中待测物用乙酸乙酯提取,浓缩至干,溶于水,用正己烷脱脂,水层过Sep-C18小柱净化,甲醇洗脱后,用BSTFA-TMCS衍生,加入甲苯并用水灭活衍生过程,用带有63Ni电子捕获检测器的气相色谱仪检测,外标法定量。当添加水平为5~20 μg/kg时,回收率为80%~108%。相对标准偏差为4.5%~11%,线性相关系数r>0.997。 'lE{Nj*7  
l(rm0_  
Sak^J.~G[  
2.3 其它分析方法 #2i$:c~  
   7#+Ih-&EQ  
    超临界流体色谱(SFC)可弥补GC和HPLC的不足,但不可能取代二者。SFC最大优点是可以方便地连接各种灵敏的检测器(MS,ECD等)。 U/{t " e  
RQWUO^&e^  
    毛细管区域电泳(CZE)兼有高压电泳的高速、高分辨率和HPLC灵活、高效的优点,可简化样品前处理、多残留分析以及使分析自动化。目前,CZE的主要问题是样品量太少,限制了检测的灵敏度,CZE-MS可能是最好的解决办法(李俊锁 1997)。 `^{G`es  
_+P*XY5  
3 联用技术 @bTm.3  
   *A!M0TK?i,  
    各种分析技术联用是现代兽药残留分析乃至整个分析化学方法上的发展特点。计算机的应用加速了这一趋势。联用技术可扬长避短,一般兼分离、定量和定性(分子结构信息)于一体,因而特别适用于确证性分析。常见的联用技术,有TLC-MS、LC-MS、GC-MS、SFC-MS、CZE-MS、LC-NMR等。 l opl  
N)cO Dy([  
    TLC-MS是最简单的离线联用技术。LC-MS现在已进入实用阶段,其灵敏度较荧光检测器高1个数量级,能方便地对ng/kg级的兽药残留组分进行检测与结构确证,是美国FDA推荐使用的氯霉素确证方法。GC-MS已相当成熟,主要采用电子轰击源(EI)和负离子化学源(NCI),EI源的气质联用法的检出限一般高于5 μg/kg,NCI源的气质联用法灵敏度高,检出限可达到0.1 μg/kg,但NCI源的气质联用仪的普及性较差。 V^FM-bg%9  
EwG+' nlE  
    Tomoko Nagata等(1996)报道了用GC-MS法检测黄尾鱼肌肉中的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的残留。该方法采用了对3种药物具有相似响应因子的电子捕获检测器(ECD),使得3种药物能在低浓度时同时检测到。用乙酸乙酯提取药物,并将提取液蒸干,残存物溶于NaCl溶液中,加适量正己烷去除脂类物质,然后再用乙酸乙酯提取药物,蒸干后将残留物用正己烷溶液和乙醚溶解,用Sep-Pak到Florisil柱提纯净化,提取物在50 ℃条件下经衍生化后,用气谱-质谱联用机检测。药物由包被有5%苯基甲基硅的毛细管柱分离,回收率大于65%,最低检出限为5 μg/kg。 s1]Pv/a=y  
   :CM-I_6  
    总的说来,基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法灵敏度较高,特异性强,试样预处理简单,分析时间短,现在已出现一些试剂盒产品,使用方便,因此,在现场监控和基层的大规模筛选检测中,免疫学检测方法更实际,有广阔的应用前景。 }Y.@:v j  
,9 ^ 5  
    国际上公认的定量确认方法仍是理化分析法,主要是气相色谱法和液相色谱法,这两种方法灵敏度高,结果准确,重复性好,假阳性少,缺点是样品前处理过程复杂、仪器化程度高且价格昂贵,分析速度慢。二者相比较,由于HPLC检出限较高,已逐渐不能满足发达国家对检测方法检出限的要求。联用技术出现后,LC-MS由于灵敏度高,检出限更低,结果精确可靠,在氯霉素残留的分析中正逐渐代替单一的色谱技术。 4J,6cOuW4  
Eyf17  
    国家水产品质量监督检验中心目前在氯霉素残留检测工作中,采用酶联免疫法对样品进行初期筛选,用配有ECD的气相色谱仪及GC-MS联用技术进行确认及定量分析,检出限可以达到1 μg/kg,完全能够满足目前检测工作的需要。并且即将采用LC-MS技术,可使检出限水平达到0.1 μg/kg,与国际当前先进水平接轨。 jN{ k }  
 
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参 考 文 献 t! Av [K  
    *JOv  
王建华,陈世山.2001.同时测定鱼肉中氯霉素和甲砜霉素残留量的毛细管气相色谱法.分析测试学报,20(3):89~91 Z=sAR(n}~  
1r w>gR  
王秉栋主编.1991.动物性食品卫生理化检验.北京:中国农业出版社,399~400 PwNLJj+%  
#wm)e)2@  
刘智宏.1995.酶标免疫测定法(EIA)在检测动物性食品中氯霉素残留的应用.中国兽药杂志,29(2):47~48 aH$*Ue@Q  
G6Fg<g9:  
李兰生,王勇强.1997.氯霉素在对虾体内的动力学研究.色谱,15(5):431~434 en~(XE1  
@o^sp|k !  
李 诚1993.抗菌药物残留检测方法研究动态.肉品卫生,10:23~25  Pr/&p0@aV  
>\p}UPx  
李俊锁.1997.兽药残留分析研究进展.中国农业科学,30(5):81~87  3i$AR  
4-n.4j|  
宋华宾.1993.动物性食品中抗生素残留及其检测方法研究进展.肉品卫生,11:20~23 _bz,G"w+:  
<(t<gS#  
胡顶飞,沈建忠.2001.氯霉素类抗生素的残留分析.中国兽药杂志,35(5): 55~57 fu&]t8MJC  
Zj<T#4?8  
蒋定国,杨大进.2002.动物性食品中氯霉素残留检测技术的研究概况(综述).中国食品卫生杂志,14(2):44~47 ?3, *  
jH G(d$h  
焦彦朝,何家香,等.2000.微生物检定法测定鲤鱼组织残留氯霉素.中国饲料,5:22~24 QtzHr  
,?f(~<Aj  
谢恺舟.2001.兽药残留分析方法.中国家禽,23(17):5~7 MdfkC6P  
d16 PY_  
Christian Hummert.1995.Determination of Chloramphenicol in animal tissue using high-performance liquid chromatography wITh a column-switching system and ultraviolet detection.J.of C. B.,668:53~58 x[kdQj2[&  
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Degrooodt J.M.,Wyhowski de Bukanski B..1992.CAP and nitrofuran residue analysis by HPLC and photodiode array detection in meat and fish. Liq.Chromatogr,15(13):2355~2371  t|DYz#]  
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George W.C..2002.Food safety first.Advocate,5(1):2 & Gt9a-ne  
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Nagata,Saeki.1992.Simultaneous determination of thiampenicol,florfenicol,and chloramphenicol residues in muscles of animals and cultured fish by liquid chromarography.J.liquid chromatogramphy,15(12):2045~2056 StVv"YY  
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Rick W.F.,Phyllis J.S..1998.Theory and methodology of antibiotic extraction from biomatrices.Journal of Chromatography A,812:3~15 z,EOyi  
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W.M.A.Niessen..1998.Analysis of antibiotics by liquid chromatography-mass spectrometry.Journal of Chromatography A,812:53~75 B+LNDnjO]  
BSY#xe V  
|<0@RCgM  
ik*_,51Zj  
_<7FR:oBZ  
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