C1q放射免疫测定法 [复制链接]

实验试剂

CFD稀释液(即VBS)，10%三氯醋酸，C1q溶液

实验设备

PEG(MW6 000)，离心机

实验步骤

1. C1q标记法C1q的同位素标记，一般用125I，也可用131I。

125I的标记有两种方法，即氯胺T法和乳过氧化物酶法。下面介绍氯胺T法：

   1) 在100μl C1q(1mg/ml)中，加入100μCi125I，混匀，然后加入25μl 0.4mol/L PB(pH值7.4，含1mg氯胺T)，冰浴中搅拌4～6min；

   2) 立即加入50μg/μl偏重亚硫酸钾中止反应，再加入50μl 1%牛血清白蛋白作为载体蛋白；

   3) 过Sephadex G25柱(20cm×0.5cm，预先用pH值7.4、0.4mol/L PB平衡，并注入1ml 1%牛血清白蛋白)，以与游离125I 分开；

   4) 以适当浓度分装后，放-70℃保存。为减少自身凝集，加入0.02%Tween20。

2. 取标记好的C1q，用CFD稀释到1mg/ml。

3. 7 000r/min离心30min(4℃)，除去不溶性凝聚蛋白，上清液存放于4℃。

4. 取试管4支，每管加测定血清0.2ml，CFD 0.2ml，标记C1q 50μl(1μg/ml)。1、2管为测定管，3、4管为对照管。

5. 摇匀后，放25℃温箱60min，取出再放4℃冰箱60min。

6. 各管加3ml PEG，最终浓渡为2.5%，摇匀后，放4℃ 2h。

7. 3、4管加10%三氯醋酸，沉淀所有的蛋白。将4个管都以1 000r/min离心20min，去上清液，沉淀物放γ计数器内测cpm。

8. 计算

B=(a加b2加c加d2)×100

B：标记C1q结合量(%)。a、b：1、2管(测定管)cpm。c、d：3、4管(对照管)cpm。

文章出自: 世科网