生物制剂中宿主残余DNA检测技术与标准的发展趋势 [复制链接]

  系列1. 生物制品中残留DNA检测标准的变化

      生物制剂是制药行业中发展最快的领域，2014年全球十大畅销药中7个是生物制剂。这些销售上的重磅炸弹在临床上疗效确切，但研发成本高，生产和质量控制要求非常严格。绝大部分生物制剂是不经过胃肠道直接进入体内，所以除了生物活性外，监管部门对药品中杂质的限量要求非常严格。其中，宿主细胞残留DNA因为具有特别的潜在安全风险，一直是国内外药品监管机构关注的重点。美国药典会从2011年开始就组织专门小组讨论修订生物制品中残留DNA检测方法，并在2014年Prescription/Non-Prescription Stakeholder Forum Meeting#5上宣布将在2015年药典修订版中增加新的章节（General Chapter <30>）来规范检测方法和标准物质。为什么美国药典会的专家组花几年时间讨论一个微量成分（<100pg/剂量）的检测方法？还要专门增加章节来规范化？

      回答这些问题，先要了解它的来源和潜在危害性。生物制品中的重组蛋白药、抗体药、疫苗等产品是用连续传代的动物细胞株表达生产，虽然经过严格的纯化工艺，但产品中仍有可能残余宿主细胞的DNA片段。这些残余DNA可能带来传染性或致瘤性风险，比如残留DNA可能携带HIV病毒或Ras癌基因。分布在哺乳动物细胞基因组的LINE-1序列可能发挥逆转录转座子作用插入到染色体中，这种插入可能影响关键基因功能的发挥，比如激活癌基因或抑制抑癌基因。

      此外，由于微生物来源的基因组DNA富含CpG和非甲基化序列，增加了重组蛋白药物在体内的免疫源性风险。目前的研究结果显示，残留DNA的致瘤性相比传染性风险要低，但考虑到致瘤性实验是动物实验，传染性实验是在细胞水平做的，或许对两方面的风险都不能掉以轻心。众所周知，外源蛋白可能引起严重免疫反应，但关于残留DNA诱导的免疫反应的研究还不多。在一些临床前和临床研究中报道了高剂量的核酸样品，比如DNA疫苗或佐剂中的CpG寡聚核苷酸，可以诱导免疫反应，还诱导产生DNA抗体。

      生物制品中宿主残余DNA既是是生产中带来的杂质，还存在一定安全隐患。因此，WHO和各国药物注册监管机构一般只允许生物制剂中存在100pg/剂量以下的残留DNA。根据杂质来源和工艺，特殊情况下最高允许10ng/剂量。

      系列3. 各种残余核酸检测技术的优劣系列

      正如前面讲过，2015年版的美国药典将新增章节对残余DNA检测进行规范化，那究竟和现有方法有什么不同？为什么最后只确定了一种方法？我们来看看现行美国药典对于残余DNA检测的总体要求[General Chapter〈1130〉 NUCLEIC ACID-BASED TECHNIQUES -APPROACHES  FOR  DETECTING  TRACE  NUCLEIC  ACIDS (RESIDUAL DNA TESTING)]。"因为残留DNA涉及到潜在来源（传染性病毒DNA）、管理规程等关键问题，药品监管部门建议必须建立产品的DNA残留检测方法。不论是否成品的常规检测包含DNA残留含量检测，还是工艺开发中已经证实了DNA清除率，残留DNA技术指标和定量分析监测规程都必须确立。分析方法包括杂交法、基于DNA结合蛋白的免疫色谱法（阀值法）、定量PCR（Q-PCR）或其他DNA扩增方法。理想的定量检测方法的灵敏度应该能够检测到约10pg/剂量的残留DNA。杂交法、阀值法和定量PCR方法因为灵敏度可以达到检测要求，所以属于经典方法。"下面我们引用美国药典（USP）<1130>的内容分别介绍一下这三种方法。

      杂交法（Hybridization-based）：在这种方法中，根据宿主DNA序列设计DNA探针用于测定产品中配对DNA的数量。双链DNA被变性成单链后固定在尼龙膜或硝化纤维膜上，DNA探针被放射或荧光随机掺入标记以后，与膜上固定的样品宿主DNA杂交结合，并在胶片或成像仪对应位置中显现斑点。对于荧光标记的探针，斑点的光密度结果可以在仪器中定量分析。斑点光密度对应结合在目标DNA上的探针数，进而推测出残留DNA的数量。通过目测方法可以半定量地检测样品中残留DNA，仪器读片可以对应斑点光密度绘制标准曲线，对应检测结果更加准确。

      DNA结合蛋白免疫阈值法（DNA-BINDING PROTEIN-BASED）：这种方法使用DNA结合蛋白和DNA抗体，分四步检测。第一步，通过加热把DNA变性成单链DNA，变性后DNA与偶联了亲和素的DNA结合蛋白以及偶联了尿素酶的DNA单克隆抗体混合反应，液相中的单链DNA、DNA结合蛋白、DNA抗体共同形成序列非特异的复合物。第二步，样品混合液通过生物素标记的膜，亲和素-生物素结合把DNA复合物固定在膜上，洗去非特异吸附。第三步，膜放入检测仪器中与尿素溶液反应，反应产物氨改变溶液pH值并被仪器记录变化。这种pH值的变化直接与样品中的DNA数目相关。第四步，仪器软件自动分析原始数据确定样品中残留DNA数量。

      定量PCR法（QUANTITATION PCR-BASED）：qPCR方法以其快速、高通量的特点已经被应用于生物制药的一些领域（拷贝数检测与病毒检测）。这项技术能够确定各种样品中目标DNA序列的准确数量。DNA探针的设计非常关键，这种DNA探针包含一端染料分子和另一端淬灭分子。当特殊设计的DNA引物引导DNA聚合酶沿着模板序列复制合成另一条对应序列时，DNA聚合酶切断结合在目标DNA上的探针染料端，释放到反应液里的染料信号被仪器测量。经过数十个循环的DNA扩增，荧光信号与起始DNA模板成对应关系，对应标准曲线可以准确计算出样品中残留DNA的数量。

      美国药典附录进一步对三种方法进行了应用评价。杂交法可以序列特异性地检测目标DNA，但32P标记的探针因为存在半衰期短、放射等问题，实际应用并不广泛。荧光标记的探针如果采用仪器读取信号，杂交法理论上可以达到定量检测要求的灵敏度，但是检测时间需要48小时。阈值法因为是采用DNA抗体的非特异序列免疫检测技术，不能特异性识别宿主残留DNA序列，且容易受到环境和操作人员的DNA污染，导致读值偏高。qPCR法具有序列特异性，灵敏度、准确度、精密度都好，还可以高通量筛选，但开发一个合格的q-PCR试剂检测宿主残留DNA并不是件容易的事情。有人会提出疑问，终产品中应该限定任何物种的DNA残余以确保安全性，所以阈值法是不是最合理的分析方法？

      这里还需要强调一下宿主残余DNA检测的目的：

      1.确认纯化工艺合理，能有效去除宿主DNA残余；

      2.确认产品中杂质含量符合标准要求。非特异性的DNA检测结果不能区分究竟是生产中污染、检测污染、或是工艺缺陷引起的DNA残余，就无法为解决方案提供有效信息。在严格的生产体系中，残留DNA检测是解决工艺合理性问题，任何外源污染问题都归SOP或GMP管理体系解决。最后，经典的残留DNA检测方法灵敏度不同，qPCR法、DNA结合法、杂交法的检测限分别达到<1、

      3、6pg/样品的水平（目前qPCR法灵敏度可达10fg），但是技术上限制，要求待测DNA片段分别不能小于50、150、600bp才能用于杂交法、q-PCR法、阈值法检测，而WHO和FDA可接受的DNA 限度内的片段长度<200bp。

      由此可见，这三种方法中，qPCR法的适用性和技术指标最好。从qPCR技术原理来看，Taqman法要优于荧光染料随机掺入的SYBR Green法。正如前面介绍的USP修订内容，经过几年来对三种检测方法的系统研究和应用反馈，美国药典会将在新版药典中唯一推荐qPCR法作为生物制品残留DNA检测的标准方法。

      系列4. 中国生物制品中残余DNA检测标准与技术

      中国参照WHO、FDA和欧盟的标准，很早以前开始就对生物制品中残余DNA的含量进行限制。酵母、大肠杆菌表达的生物制品限定不超过10ng/剂，CHO和vero细胞表达的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超过100或10pg/剂。2010年版中国药典附录收录了DNA 探针杂交法和荧光染料法作为残余DNA检测方法。以地高辛标记斑点杂交法为代表的DNA杂交法因为操作复杂，耗时较长，且只能半定量，在2014年美国药典修订版征询意见稿中（ PF40(2)）中已经被剔除。以PicoGreen为代表的荧光染料法是基于荧光染料分子直接与双链DNA结合后，经带有荧光检测功能的酶标仪激发后产生荧光信号，因为不能检出单链DNA，且没有序列特异性，以及灵敏度较低（>300pg）等原因，早已被欧美药典摒弃。

      中国2010版药典及2015版药典（附录IX B 外源性 DNA 残留量测定法）的征求意见稿中收载了的DNA探针杂交法和荧光染料法，而2009年美国USP就收录了杂交法、阈值法和qPCR法，到2015年底USP将只收录高灵敏度、高特异性的qPCR法作为残留DNA检测的推荐方法。由此可见qPCR法将成为国际公认的残留DNA检测方法，也可能会是我国下一版药典的主要修订内容。国内生物制品研发与生产企业，以及生产纯化填料的上下游企业，尽早建立以qPCR方法为基础的宿主残余DNA检测体系，将有利于改进工艺、提高产品质量，实现与欧美发达国家生物药品标准的接轨。