核黄素与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究 EUXV/QV{
尚永辉3 1 ,2 , 李 华2 , 孙家娟1 , 郑敏燕1 :3 PG f
(1. 咸阳师范学院化学与化工学院,陕西咸阳712000 ; 2:n|x5\H
2. 西北大学分析科学研究所,陕西西安710069) XNK
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摘 要:采用荧光猝灭光谱、同步荧光光谱研究了核黄素与牛血清白蛋白(BSA) 相互作 ] :GfOgo
用的光谱行为。结果发现,在温度为293 K 和310 K 时核黄素与BSA 的结合常数( Kb ) 分别为4. 879 ×105 L•mol- 1 和1. 880 ×105 L•mol- 1 ,结合热力学方程计算得到了对应温度下的热力学参数。结果表明核黄素对BSA 有较强的荧光猝灭作用,其荧光猝灭过程属于动态猝灭机制,二者主要靠疏水作用力结合。采用同步荧光光谱探讨了核黄素对BSA 构象的影响。 C,R,:zR
关键词:核黄素;牛血清白蛋白;荧光光谱 &F86SrsI
中图分类号:O657. 39 文献标识码:A 文章编号:100626144 (2010) 0120067204 R$v i!0
血清白蛋白是人和动物血清中含量最丰富的一种蛋白质,与各种带正负电荷的物质及电中性物质均有一定程度的相互作用。各种药物进入体内首先与血清白蛋白结合,通过血浆的存储和运输,到达受体部位产生药理作用[ 1 ] 。测定血清白蛋白的变化,可为疾病诊断、疗效观察提供有价值的资料及数据。因此,从不同角度研究以白蛋白为代表的蛋白质与具有生物活性小分子间的相互作用,对了解药物的作用机制具有重要意义。通过对荧光光谱的研究,可以获得蛋白质分子中荧光生色基团的种类、结构和所处微环境及其分布情况等有用信息,同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据。目前已有多篇文献采用荧光光谱法研究药物分子如槲皮素[3 ] 、甲基硫菌灵[4 ] 等与血清白蛋白的相互作用。 ^U"
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核黄素(Riboflavin ,RI) 又称维生素B2 ,是人体必需的13 种维生素之一,具有促进发育和细胞的再生;促使皮肤、指甲、毛发的正常生长;消除口腔内、唇、舌的炎症;减轻眼睛的疲劳增进视力,协助代谢碳水化合物、脂肪、蛋白质等多种功能。同时还具有利尿消肿,防治肿瘤,降低心脑血管病的发生等保健功效。
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本文采用荧光光谱法研究了核黄素与牛血清白蛋白(BSA) 间的相互作用,探讨了核黄素与BSA 作用机制,计算得到荧光猝灭常数,以及与BSA 作用的结合常数和结合位点数等信息。 *;Ak5.du
1 实验部分 wiKCr/
1. 1 试剂与仪器 `$f\ %
RF25301 型荧光分光光度计(日本,岛津公司) ;UV28453 型紫外分光光度计(日本,日立公司) ; TB285型恒温水浴(日本,岛津公司) ;p HSJ24A p H 计(上海雷磁仪器厂) 。 Mn-<5 1.%
牛血清白蛋白(Amresco. 0930 ,分子量:65 000) ;核黄素(中国药品生物制品检定所) ;p H = 7. 40 的Tris2HCl 缓冲溶液;以Tris2HCl 缓冲溶液为溶剂配制1. 0 ×10 - 3 mol•L - 1 的BSA 标准溶液,1. 0 ×10 - 3mol•L - 1 核黄素标准溶液,两种标准溶液均在0~4 ℃冰箱中保存。实验所需浓度由此稀释而得。Tris ,HCl ,NaCl均为分析纯;水为双重蒸馏水_。 M2a}x+5'
1. 2 实验方法 A"`L~|&
在10 mL 比色管中依次加入p H = 7. 40 的Tris2HCl 缓冲溶液2 mL ,1. 0 ×10 - 3 mol/ L BSA 溶液0. 5mL 以及一定量核黄素溶液,用0. 1 mol/ L NaCl水溶液稀释至刻线后混匀,在实验温度下恒温1 h ,采用1 cm石英池,激发波长为285 nm ,绘制300~450 nm 的荧光光谱,并分别以△λ= 60 nm 和△λ= 15 nm 扫描其同步荧光光谱,测定时入射狭缝均为10 nm ,出射狭缝均为5 nm。 EP/&m|o|G
2 结果与讨论 $/MY,:*e
2. 1 荧光猝灭光谱 'o7R/`4KR
按照实验方法测定不同温度条件下BSA 溶液中加入不同量核黄素的荧光光谱(图1) 。 (=6P]~,
由于蛋白质中存在色氨酸和酪氨酸,使其具有内源荧光,由图1 可知:当固定BSA 的量,随着核黄素浓度的增加,BSA 的荧光强度不断降低,荧光峰逐渐蓝移,说明核黄素与BSA 发生了相互作用,这种作用可能引起BSA 中荧光发色团的微环境及蛋白质分子构象行为的变化[5 ] 。进一步研究发现在293 K 和310 K条件下加入核黄素的浓度与BSA 荧光猝灭值△F( △F = F0 - F, F、F0 分别指有无RI 时的荧光强度) 分别在0~0. 6 ×10 - 5 mol/ L 、0~0. 4 ×10 - 5 mol/ L 范围内呈良好的线性关系,回归系数R 分别为0. 9982 、0. 9938 ,该法可用于核黄素浓度的测定。 9 Zs#Ky/
2. 2 荧光猝灭机理及结合常数的基本确定 (}VuiNY<