1、纯化的一般目标和方法 zS]Yd9;X1
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首先,自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤(例如:匀浆、离心、硫酸铵沉淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品。 R2-OT5Ej
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然后进行捕获色谱(capture chromatography),主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质,此步最关心的是流速和载量,常采用高载量、快流速凝胶。 A{Jv`K
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经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediate chromatography),目的是去除较难去除的杂质,此步最关心的是分辨率,常采用高分辨率的细颗粒凝胶。 "n=`{~F
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最后为了得到符合要求的最终产品,去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断,进行精制色谱(polishing chromatography),常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。 =;9Wh!{
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2、纯化前的准备工作 \f}S Hh
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(1)样品稳定性试验a、测定样品在pH 2-9的稳定性;b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性;c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性;d、测定样品在4-40℃的稳定性;e、室温下静置过夜,测定对蛋白水解酶的稳定性。 ;]D@KxO$dJ
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(2)样品预处理a、去除样品中颗粒物(0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟) };o6|e:2E
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b、去除样品中脂类( 10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提) Q.7Rv
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c、去除样品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀) vmK<_xbwd
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d、抑制样品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白) .%_scN
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(3)样品的保存条件:短期储存(小于24小时) SoeL_#+^W
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a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存(数天) |0:<Z(
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a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者最好冻干(真空冷冻干燥)保存。 bDVz+*bU}
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3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立 `K37&b