1、纯化的一般目标和方法 5|AZ/!rb V @8X.R> 首先,自然来源或者重组表达的
蛋白质经过一些粗提的步骤(例如:匀浆、离心、硫酸铵沉淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品。
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81\cg 然后进行捕获色谱(capture chromatography),主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质,此步最关心的是流速和载量,常采用高载量、快流速凝胶。
,kLeK{ HLk/C[`u, 经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediate chromatography),目的是去除较难去除的杂质,此步最关心的是分辨率,常采用高分辨率的细颗粒凝胶。
V1(eebi| }~\J7R' 最后为了得到符合
要求的最终
产品,去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断,进行精制色谱(polishing chromatography),常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。
bv|v9_i D b(a;o 2、纯化前的准备工作 RCoz;|c`P k9Yr&8B (1)样品稳定性试验a、测定样品在pH 2-9的稳定性;b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性;c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性;d、测定样品在4-40℃的稳定性;e、室温下静置过夜,测定对蛋白水解酶的稳定性。
{K:/(\ |[xi"E\ (2)样品预处理a、去除样品中颗粒物(0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟)
48w3gye !$Mv)c/_u b、去除样品中脂类( 10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提)
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1YhYA c、去除样品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀)
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,j d、抑制样品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白)
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9F&XF7{ (3)样品的保存条件:短期储存(小于24小时)
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,: a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存(数天)
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< &ViIxJZ1$ a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者最好冻干(真空冷冻干燥)保存。
pcm| Hm1C|Qb 3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立 ]TqcV8Q~ ^:LF a、目的蛋白含量测定酶活性测定、
生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。
ml\7JW6Rx t55CT6Se b、总蛋白含量测定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法(考马斯亮兰G-250)等。
?Q:se Ypha{d c、样品复杂度
检测HPLC(离子交换、凝胶过滤、反相)、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳(CE)。
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)<IbQH|_ 4、蛋白质的来源 N~Ax78TX R*VZ=i (1)天然蛋白: 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂,在分离过程中须采用多步骤才能去除各种杂质,并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。
-D38>#Y 7o0ej# (2)重组蛋白: 重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位:
G'}%m;-mt u&2uQ-T0 a、细胞质:在种情况下,必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质,同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放;在表达量较高的条件下,一般形成包涵体,包涵体含有过表达目的蛋白,且容易通过高速离心分离,但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。
h`&mW w BU]9eF!>h b、外周质: 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间,这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的
作用并减少了宿主蛋白的
污染。
D#^v=U O:p~L`o>> c、分泌到培养基:这种表达一般蛋白质浓度较低,主要受到培养基中的污染。
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