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荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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离线sino

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只看该作者 10楼 发表于: 2012-10-30
%[s%H)e)  
7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析; >C!^%e;m  
目前市场上有许多种实时PCR仪:其中包括ABI7700,ABI7900,ABI7000 (Alied Biosystems);MX4000 (Stratagene);iCycler (Bio-Rad);Smartcycler(Cepheid);Robocycler (MJ Research);Lightcycler (Roche);ROTORGENE(CORBERT) ;杭州博日(Linegene)。 OG$v"Yf~  
不同的仪器使用方法有所区别,但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG(hot start)和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 vJ=Q{_D=\  
为确保实验数据的有效性,每次实验都设阴性对照和4个标准品,每个样品都平行做2个复孔。 !U>WAD9  
基线或阀值的设定 通常是以10-15个循环的荧光值作为阀值,也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 qIQRl1Tw;V  
7`&ISRU4  
8、疑难解答  Owi/e  
5B4/2q=  
可能原因
建议解决方法
% dg[ho  
定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量
zU+q03l8Ur  
DNA模板质量不好,含有抑制剂
]VLseF  
提高模板质量,诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA
uW[[8+t|  
PCR引物设计较差
wN4#j}C  
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
#o4tG  
探针设计较差
bNVeL$'  
对探针序列进行blast比对,设计符合要求的探针
Q]/%Y[%|  
PCR引物合成较差
%}VH5s9\  
用普通电泳法,看引物的设计和合成质量,是否有目的条带出现。
%csrNf  
荧光探针无功能
t'Wv? ,  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 4F6aPo2  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 A!B.+p[ G  
必要的话设计和合成探针。
`{G&i\"n  
模板浓度太低
KaNs>[a8  
使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
g=56|G7n  
镁离子浓度太低
:]@c%~~!&  
从3mM到5mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
jRS{7rx%MH  
引物浓度太低
rQVX^  
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见公式1
0B]q /G(  
选择优质酶进行扩增
Gs,:$Im  
选择hot start Taq酶进行扩增,可提高灵敏度,增加产量,降低干扰因素
:x*)o+  
退火温度太高
LKu\Mh|  
使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。
E[]5Od5#  
反应物中有不明物干扰
_s=H|#l  
在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰,对任何实验样品或试剂,均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
cQU;PH]  
定量PCR阳性对照无扩增曲线(针对:已经优化好的体系)
I+8n;I)]X  
引物、探针设计合格;原来合成质量已经验证。需确认:
`<C<[JP:o  
反应成分是否漏加;确定反应条件是否合适; J?QS7#!%  
正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题; pjWRd_h.  
确认体系:1、引物是否降解(看扩增产物是否可电泳出)来判断引物和酶功能;2、探针是否降解(用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强)。
iVXt@[  
仪器是否正常工作
}e?H(nZS7h  
 ?Y(  
定量PCR阴性对照一直有扩增曲线
b2m={q(s  
模板或PCR残余污染
cm< #zu3~S  
隔离污染来源,更换试剂。 i5VZ,E^E  
使用UNG/dUTP防污染系统。 #De>EQ%  
使用专用的精致移液器。 mci> MEb  
在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。
".?4`@7F\  
体系有问题
-@pjEI  
酶浓度不对,Mg离子浓度不对
I Dohv[#  
定量PCR(染料法)出现非特异信号
sy: xA w  
引物二聚体多
-$Oh.B`i  
检查引物设计和合成环节,必要时更改引物
50,'z?-_  
更换热启动酶
@-U\!Tf  
热启动酶能增加反应的特异性,提高灵敏度
-ss= c#  
设定检测信号时的温度
-`O{iHfM|P  
在更高的温度下检测荧光信号(此时引物二聚体已经解链)
c_J9C Kqc  
定量RT-PCR x~5uc$  
无扩增产量 8wU$kK  
相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照
p~D}Iyww1_  
无cDNA合成
OVg&?fiP  
G|6qL  
cDNA合成温度太高
kAftW '  
降低保温温度
|RX#5Q>z  
反转录cDNA产物被二级结构封闭
N} EKV  
提高保温温度。重新设计引物
WAu>p3   
RNA被损害或降解
Q\Ek U.[I  
必要的话更换RNA
sf*4|P }  
RNAse污染
hU?DLl:bXF  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
%>KbaM1b  
荧光探针无功能
: auR0FE  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 +nYFL e  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 wZvv5:jKpu  
必要的话设计和合成探针。
BT7{]2?&V  
灵敏度低 rA~f68h|  
须在比预期更高的循环中检出产物(Ct滞后)
O}M-6!%<,  
初始模板RNA不充分
WZQ2Mi<&1'  
增加模板RNA的浓度;使用10ng-1µg的总RNA
3^8Cc(bk  
RNA被损害和降解
VF`!ks  
必要的话更换RNA
*b{IWOSe^  
RNAse污染
]az(w&vqg2  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
,L ig6Z`  
无效的cDNA
K43%9=sM  
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
ng}C$d . I  
无效的PCR扩增
,,Qg"C  
注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 Ema[M5$R  
调整cDNA合成温度或引物设计
SkjG}  
检测使用仪器
|Y3w6!$  
扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查,是整体滞后还是个别孔滞后
UT;%I_i!'  
PCR忠实性:PCR在产物序列中引入了错误
hF'VqJS  
采用荧光探针法
505c(+  
增加结果特异性和产物的忠实性
JwI99I'  
循环数太多
[FBS|v#T  
降低循环数。
7Fj8Mp|  
四种dNTP的浓度不同
rl}<&aPH  
制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。
@&?(XY 'M%  
离线sino

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其他问题: E @r &K  
1)、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用? TyO]|Q5  
 ~9YEb  
>8>s K(S]  
通常国外的文献可信度比较高,可直接使用;但为了保险起见,最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证;或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析,这样更有利于您对整个实验的把握。 L8E4|F}  
2)、在实验之前要进行哪些准备工作? P7X3>5<;q  
首先要不加探针做常规的PCR实验,验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适,可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 7<:o4\q?m  
3)、标本的采集和处理应该注意什么问题?  Bvj  
根据实验要求和目的,有针对性采集病灶部位的标本;采集好的标本,最好根据每次实验用量,用冻存管分成几小份,放在-80℃保存,以免反复冻融;标本通常分成3类,如细胞组织、分泌物、血清全血;如果是血清,不能有融血现象的发生,否则会影响PCR的扩增;如果是全血,最好不用EDTA作为抗凝剂,选用柠檬酸作为抗凝剂,否则会影响PCR的扩增;如果是组织,最好用蛋白酶K消化;如果是提RNA的标本,更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 $? Z}hU  
4)、在做荧光定量实验时要注意些什么呢?  b utBS  
见产品操作注意事项。 2.{zf r  
5)、如果出现污染该怎么办? o=zl{tZV  
以替换法确定污染从何而来,对症下药,值得注意的是,因荧光定量PCR的敏感度极高,从防止污染的角度出发,最好在体系中加有dUTP,一旦出现污染现象,可以用UNG酶消除;同时将实验室分成4个区,即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。
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