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荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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离线sino

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只看该作者 10楼 发表于: 2012-10-30
K/T4T\  
7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析; X(r$OZ  
目前市场上有许多种实时PCR仪:其中包括ABI7700,ABI7900,ABI7000 (Alied Biosystems);MX4000 (Stratagene);iCycler (Bio-Rad);Smartcycler(Cepheid);Robocycler (MJ Research);Lightcycler (Roche);ROTORGENE(CORBERT) ;杭州博日(Linegene)。 3lh^maQ]  
不同的仪器使用方法有所区别,但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG(hot start)和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 |.]g&m)y^h  
为确保实验数据的有效性,每次实验都设阴性对照和4个标准品,每个样品都平行做2个复孔。 @m`1Vq?O  
基线或阀值的设定 通常是以10-15个循环的荧光值作为阀值,也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。  -F->l5  
6'Sq|@VOi  
8、疑难解答 au+6ookT  
v % c-El%  
可能原因
建议解决方法
V;N'?Gu  
定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量
5w9oMM {  
DNA模板质量不好,含有抑制剂
sKCfI]  
提高模板质量,诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA
=w,cdU*  
PCR引物设计较差
1EmZ/@k/Y  
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
5Sh.4A\  
探针设计较差
c{(4s6D  
对探针序列进行blast比对,设计符合要求的探针
f53WDI6  
PCR引物合成较差
.9uw@ Eq  
用普通电泳法,看引物的设计和合成质量,是否有目的条带出现。
yN/Uyhq  
荧光探针无功能
$`'%1;y@  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。  \LP?,<  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 }" \ jB  
必要的话设计和合成探针。
-. J@  
模板浓度太低
%YLyh?J  
使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
;p8,=w  
镁离子浓度太低
D//uwom  
从3mM到5mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
^2<nn op  
引物浓度太低
.!2Ac  
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见公式1
41s[p56+@  
选择优质酶进行扩增
B,NHy C1i  
选择hot start Taq酶进行扩增,可提高灵敏度,增加产量,降低干扰因素
4+2hj*I  
退火温度太高
Z.{r%W{2  
使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。
*<IQ+oat,a  
反应物中有不明物干扰
i9B1/?^W&  
在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰,对任何实验样品或试剂,均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
!<AY0fpY  
定量PCR阳性对照无扩增曲线(针对:已经优化好的体系)
u EE#A0  
引物、探针设计合格;原来合成质量已经验证。需确认:
F qH@i Z  
反应成分是否漏加;确定反应条件是否合适; ZnXq+^ Z4  
正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题; FZJyqqA$_  
确认体系:1、引物是否降解(看扩增产物是否可电泳出)来判断引物和酶功能;2、探针是否降解(用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强)。
= k|hH~  
仪器是否正常工作
(Gp|K6  
Yv7`5b{N.  
定量PCR阴性对照一直有扩增曲线
I]B[H6  
模板或PCR残余污染
2Hj;o  
隔离污染来源,更换试剂。 fNZ:l=L3):  
使用UNG/dUTP防污染系统。 ^{(i;IVG  
使用专用的精致移液器。 B9Z=`c.T  
在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。
/ar/4\b  
体系有问题
[ Cu3D  
酶浓度不对,Mg离子浓度不对
GK. U_`4?  
定量PCR(染料法)出现非特异信号
cQ<* (KU  
引物二聚体多
9CW8l0  
检查引物设计和合成环节,必要时更改引物
v*.#LJEm  
更换热启动酶
M_monj}Z  
热启动酶能增加反应的特异性,提高灵敏度
i@|.1dWh  
设定检测信号时的温度
sJ(q.FRM'  
在更高的温度下检测荧光信号(此时引物二聚体已经解链)
0Fi&7%  
定量RT-PCR `9yR,Xk=l  
无扩增产量 5NECb4FG  
相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照
:.,3Zw{l  
无cDNA合成
68v59)0U  
{<_9QAS  
cDNA合成温度太高
$3C$])k  
降低保温温度
8*V8B=q} K  
反转录cDNA产物被二级结构封闭
x# &ZGFr~  
提高保温温度。重新设计引物
nPj/C7j  
RNA被损害或降解
-S(_ZbeN  
必要的话更换RNA
V,@Y,  
RNAse污染
E*t0ia8  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
;%R+]&J  
荧光探针无功能
H@8g 9;+  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 jSj (ZU6  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 Cl+TjmOV\`  
必要的话设计和合成探针。
2Rp'ju~O)/  
灵敏度低 CbA2?(1o1  
须在比预期更高的循环中检出产物(Ct滞后)
M!s@w%0?'  
初始模板RNA不充分
B !hrr  
增加模板RNA的浓度;使用10ng-1µg的总RNA
f'\NGL  
RNA被损害和降解
h|!F'F{  
必要的话更换RNA
p5KM(N6f  
RNAse污染
tN 5brf  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
j;O{Hvvz  
无效的cDNA
U?6YY` A8  
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
*yv@-lP5s  
无效的PCR扩增
%KeQp W  
注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 l.i"Z pik  
调整cDNA合成温度或引物设计
TXi$Q%0W  
检测使用仪器
=#i#IF42?  
扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查,是整体滞后还是个别孔滞后
6t5)r lT  
PCR忠实性:PCR在产物序列中引入了错误
c?0uv2*Yh  
采用荧光探针法
sX3Vr&r  
增加结果特异性和产物的忠实性
&Z+a (  
循环数太多
|n;gGR\  
降低循环数。
[FKmZzEy  
四种dNTP的浓度不同
Y962rZ  
制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。
3:a}<^DuCS  
离线sino

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其他问题: AQ0L9?   
1)、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用? 5@Py`  
UZ] (X/  
x!YfZ*  
通常国外的文献可信度比较高,可直接使用;但为了保险起见,最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证;或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析,这样更有利于您对整个实验的把握。 Y$Uvt_  
2)、在实验之前要进行哪些准备工作? &kO4^ A  
首先要不加探针做常规的PCR实验,验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适,可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 v<2+yZ M  
3)、标本的采集和处理应该注意什么问题? /VJ@`]jhDf  
根据实验要求和目的,有针对性采集病灶部位的标本;采集好的标本,最好根据每次实验用量,用冻存管分成几小份,放在-80℃保存,以免反复冻融;标本通常分成3类,如细胞组织、分泌物、血清全血;如果是血清,不能有融血现象的发生,否则会影响PCR的扩增;如果是全血,最好不用EDTA作为抗凝剂,选用柠檬酸作为抗凝剂,否则会影响PCR的扩增;如果是组织,最好用蛋白酶K消化;如果是提RNA的标本,更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 d!wd,Xj}  
4)、在做荧光定量实验时要注意些什么呢? BO h  
见产品操作注意事项。 UoKBcarm  
5)、如果出现污染该怎么办? #bdJ]v.n  
以替换法确定污染从何而来,对症下药,值得注意的是,因荧光定量PCR的敏感度极高,从防止污染的角度出发,最好在体系中加有dUTP,一旦出现污染现象,可以用UNG酶消除;同时将实验室分成4个区,即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。
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