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荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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离线sino

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只看该作者 10楼 发表于: 2012-10-30
sgO au\E  
7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析; /Pe xtj<  
目前市场上有许多种实时PCR仪:其中包括ABI7700,ABI7900,ABI7000 (Alied Biosystems);MX4000 (Stratagene);iCycler (Bio-Rad);Smartcycler(Cepheid);Robocycler (MJ Research);Lightcycler (Roche);ROTORGENE(CORBERT) ;杭州博日(Linegene)。 x'0_lf</ #  
不同的仪器使用方法有所区别,但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG(hot start)和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 xS UpVK  
为确保实验数据的有效性,每次实验都设阴性对照和4个标准品,每个样品都平行做2个复孔。 }vh <x6  
基线或阀值的设定 通常是以10-15个循环的荧光值作为阀值,也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 MB;rxUbhe3  
[;{xiW4V]  
8、疑难解答 R]yce2w"z  
q6pHL  
可能原因
建议解决方法
x%s1)\^A  
定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量
WyOav6/*K^  
DNA模板质量不好,含有抑制剂
,Z @I" &H  
提高模板质量,诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA
6am6'_{  
PCR引物设计较差
OK v2..8  
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
tm/ >H  
探针设计较差
L+G0/G}O\  
对探针序列进行blast比对,设计符合要求的探针
9<0yz?b':  
PCR引物合成较差
QGI@5  
用普通电泳法,看引物的设计和合成质量,是否有目的条带出现。
q)9n%- YgP  
荧光探针无功能
hBRi5&%  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 wbJBGT{sm  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 eI"pRH*f  
必要的话设计和合成探针。
st* sv}  
模板浓度太低
4Cu \|"5)  
使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
p?#T^{Quz~  
镁离子浓度太低
~tWh6-:|{J  
从3mM到5mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
#8M?y*<I  
引物浓度太低
W/\VpD) ?;  
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见公式1
UFT JobU  
选择优质酶进行扩增
MvZa;B  
选择hot start Taq酶进行扩增,可提高灵敏度,增加产量,降低干扰因素
D|Q7dIZm  
退火温度太高
w!H(zjv&(  
使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。
q\?p' i  
反应物中有不明物干扰
^?H|RAp  
在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰,对任何实验样品或试剂,均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
-t S\  
定量PCR阳性对照无扩增曲线(针对:已经优化好的体系)
3 e'6A^#  
引物、探针设计合格;原来合成质量已经验证。需确认:
2<B'PR-??y  
反应成分是否漏加;确定反应条件是否合适; Ws|`E `6O  
正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题; TMMJ5\t2  
确认体系:1、引物是否降解(看扩增产物是否可电泳出)来判断引物和酶功能;2、探针是否降解(用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强)。
;<Z6Y3>I8  
仪器是否正常工作
Kw`CN  
2rT^OGw6  
定量PCR阴性对照一直有扩增曲线
y(QFf*J  
模板或PCR残余污染
Gu~*ZKyJ  
隔离污染来源,更换试剂。 p" >*WQ   
使用UNG/dUTP防污染系统。 )%Fwfb  
使用专用的精致移液器。 NCkI[d]B@  
在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。
PhC3F4  
体系有问题
A811VL^  
酶浓度不对,Mg离子浓度不对
x ']'ODs  
定量PCR(染料法)出现非特异信号
1`7zYW&L  
引物二聚体多
oV:oc,  
检查引物设计和合成环节,必要时更改引物
I2*rtVAP'j  
更换热启动酶
Pt"H_SW~k  
热启动酶能增加反应的特异性,提高灵敏度
;`#R9\C=h  
设定检测信号时的温度
0h@FHw2d  
在更高的温度下检测荧光信号(此时引物二聚体已经解链)
W\kli';jyC  
定量RT-PCR +>q#eUS)  
无扩增产量 *(Dmd$|0|  
相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照
Kb?{^\FiU  
无cDNA合成
uMg\s\Z  
bGWfMu=n  
cDNA合成温度太高
KR aL+A  
降低保温温度
kMQ /9~  
反转录cDNA产物被二级结构封闭
~w>h#{RB  
提高保温温度。重新设计引物
Z0Z6a Zeb  
RNA被损害或降解
f4f2xe7\Q  
必要的话更换RNA
X 0y$ xC|<  
RNAse污染
*1dDs^D#|  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
n[ B~C  
荧光探针无功能
OldOc5D  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 I'uwJy_I\  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 !ZBtX t#P  
必要的话设计和合成探针。
^LMgOA(7  
灵敏度低 VPUVPq~ &  
须在比预期更高的循环中检出产物(Ct滞后)
Cu[-<>my  
初始模板RNA不充分
W:d p(,L  
增加模板RNA的浓度;使用10ng-1µg的总RNA
sl]< A[jR  
RNA被损害和降解
S0,\{j  
必要的话更换RNA
3P cVE\GN  
RNAse污染
_Iy\,<  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
X,QsE{  
无效的cDNA
%**f`L%jN  
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
*M.xVUPr  
无效的PCR扩增
{7NGfzwp;6  
注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 '/W$9jm  
调整cDNA合成温度或引物设计
:L[>!~YG_n  
检测使用仪器
2xI|G 3U  
扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查,是整体滞后还是个别孔滞后
F/>_PH57  
PCR忠实性:PCR在产物序列中引入了错误
1vj/6L  
采用荧光探针法
yeo&Qz2vU  
增加结果特异性和产物的忠实性
R@vcS=m7  
循环数太多
Tg\bpLk0=  
降低循环数。
V>Wk\'h  
四种dNTP的浓度不同
wKV4-uyr  
制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。
j)A#}4jd  
离线sino

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其他问题: T(|'.&a  
1)、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用? 5es t  
0U42QEG2  
}'[>~&/"  
通常国外的文献可信度比较高,可直接使用;但为了保险起见,最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证;或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析,这样更有利于您对整个实验的把握。 jAJ='|[X\  
2)、在实验之前要进行哪些准备工作? 2|pTw5z~  
首先要不加探针做常规的PCR实验,验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适,可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 WJ{Iv] }9  
3)、标本的采集和处理应该注意什么问题? Ai/X*y:[?  
根据实验要求和目的,有针对性采集病灶部位的标本;采集好的标本,最好根据每次实验用量,用冻存管分成几小份,放在-80℃保存,以免反复冻融;标本通常分成3类,如细胞组织、分泌物、血清全血;如果是血清,不能有融血现象的发生,否则会影响PCR的扩增;如果是全血,最好不用EDTA作为抗凝剂,选用柠檬酸作为抗凝剂,否则会影响PCR的扩增;如果是组织,最好用蛋白酶K消化;如果是提RNA的标本,更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 %=**cvVy  
4)、在做荧光定量实验时要注意些什么呢? N'{[BA(eE  
见产品操作注意事项。 ~${~To8$CW  
5)、如果出现污染该怎么办? 0O3O^ 0  
以替换法确定污染从何而来,对症下药,值得注意的是,因荧光定量PCR的敏感度极高,从防止污染的角度出发,最好在体系中加有dUTP,一旦出现污染现象,可以用UNG酶消除;同时将实验室分成4个区,即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。
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