论坛风格切换切换到宽版
  • 2528阅读
  • 11回复

荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

上一主题 下一主题
离线sino

发帖
222
世科币
522
威望
267
贡献值
341
银元
0
只看该作者 10楼 发表于: 2012-10-30
&!jq!u$(  
7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析; S$e Dnw~$  
目前市场上有许多种实时PCR仪:其中包括ABI7700,ABI7900,ABI7000 (Alied Biosystems);MX4000 (Stratagene);iCycler (Bio-Rad);Smartcycler(Cepheid);Robocycler (MJ Research);Lightcycler (Roche);ROTORGENE(CORBERT) ;杭州博日(Linegene)。 JDv-O&]  
不同的仪器使用方法有所区别,但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG(hot start)和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 Z )&D`RCf  
为确保实验数据的有效性,每次实验都设阴性对照和4个标准品,每个样品都平行做2个复孔。 bU`=*  
基线或阀值的设定 通常是以10-15个循环的荧光值作为阀值,也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 NP/>H9Q2%  
wqD5d   
8、疑难解答 ~ y;y(4<  
&Y7C0v  
可能原因
建议解决方法
;GsQR+en  
定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量
}+R B =#~o  
DNA模板质量不好,含有抑制剂
=Q(vni83<  
提高模板质量,诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA
R 1ktj  
PCR引物设计较差
(/h5zCc/v  
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
c ~F dx  
探针设计较差
N/~N7Mw Jj  
对探针序列进行blast比对,设计符合要求的探针
*'ZN:5%H  
PCR引物合成较差
:&Vc B$  
用普通电泳法,看引物的设计和合成质量,是否有目的条带出现。
5bX6#5uP1  
荧光探针无功能
H+Z SPHs  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 ;-@=  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 w+AuMc  
必要的话设计和合成探针。
l]# !+@  
模板浓度太低
q<{NO/Mm  
使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
=mt?C n}  
镁离子浓度太低
J|QiH<  
从3mM到5mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
%XRN]tsu  
引物浓度太低
z,Lzgh  
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见公式1
Omyt2`q  
选择优质酶进行扩增
y!Cc?$]_Y  
选择hot start Taq酶进行扩增,可提高灵敏度,增加产量,降低干扰因素
Np,2j KF(  
退火温度太高
v%91k  
使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。
fC<m^%*zgA  
反应物中有不明物干扰
2[R$RpA_  
在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰,对任何实验样品或试剂,均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
r/r:oXK  
定量PCR阳性对照无扩增曲线(针对:已经优化好的体系)
tk?UX7F  
引物、探针设计合格;原来合成质量已经验证。需确认:
shFc[A,r}  
反应成分是否漏加;确定反应条件是否合适; o$J6 ~ dn  
正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题; h4`9Cfrq,  
确认体系:1、引物是否降解(看扩增产物是否可电泳出)来判断引物和酶功能;2、探针是否降解(用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强)。
^Kq|ID AP  
仪器是否正常工作
'"xiS$b(  
V2 `> ]/|  
定量PCR阴性对照一直有扩增曲线
+_mr  
模板或PCR残余污染
Mg? L-C  
隔离污染来源,更换试剂。 KH<v@IJ\  
使用UNG/dUTP防污染系统。 Pes =aw  
使用专用的精致移液器。 _z"o1`{w  
在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。
^gg!Me  
体系有问题
K wFXB  
酶浓度不对,Mg离子浓度不对
nCaLdj?  
定量PCR(染料法)出现非特异信号
O E|+R4M  
引物二聚体多
<\D Uo0]J  
检查引物设计和合成环节,必要时更改引物
0yQe5i}  
更换热启动酶
<}2A=~ _  
热启动酶能增加反应的特异性,提高灵敏度
NG)7G   
设定检测信号时的温度
UK:M:9  
在更高的温度下检测荧光信号(此时引物二聚体已经解链)
X[{\ 3Av  
定量RT-PCR 8b~7~VCk  
无扩增产量 Y[,U_GX/R  
相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照
1gAc,s2  
无cDNA合成
!vrnoFVu  
;]u1~  
cDNA合成温度太高
J\GKqt;5@  
降低保温温度
y|LXDq4Wj  
反转录cDNA产物被二级结构封闭
lDH_ Y]bM  
提高保温温度。重新设计引物
A7e_w 7?a  
RNA被损害或降解
GZ.?MnG  
必要的话更换RNA
/$<JCNGv  
RNAse污染
Je@p5(f  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
8L@UB6b\  
荧光探针无功能
E^'C "6  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 d+1L5}Jn  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 U_.n=d~B  
必要的话设计和合成探针。
Z={UM/6w  
灵敏度低 ^ON-#  
须在比预期更高的循环中检出产物(Ct滞后)
xuw//F  
初始模板RNA不充分
w;z@py  
增加模板RNA的浓度;使用10ng-1µg的总RNA
>Lo6='G  
RNA被损害和降解
S]Yu6FtWiO  
必要的话更换RNA
\emT:Frb  
RNAse污染
WW,r9D:/  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
38zR\@'j]4  
无效的cDNA
b{9HooQ{  
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
oj,Vi-TZ  
无效的PCR扩增
)dzjz%B)  
注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 ;dpS@;v  
调整cDNA合成温度或引物设计
oIu,rjb  
检测使用仪器
L?/M2zc 9Y  
扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查,是整体滞后还是个别孔滞后
cZ7F1H~  
PCR忠实性:PCR在产物序列中引入了错误
hP6fTZ=Ln  
采用荧光探针法
X/?h!Y}  
增加结果特异性和产物的忠实性
ES2d9/]p-  
循环数太多
} cH"lppX  
降低循环数。
>GF(.:7  
四种dNTP的浓度不同
J*W;{Vty  
制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。
|^&2zyUj/  
离线sino

发帖
222
世科币
522
威望
267
贡献值
341
银元
0
只看该作者 11楼 发表于: 2012-10-30
其他问题: l;2bBx7vW  
1)、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用? yZ{YIy~  
=pNkS1ey  
(<CLftQKg  
通常国外的文献可信度比较高,可直接使用;但为了保险起见,最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证;或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析,这样更有利于您对整个实验的把握。 qH ~usgqB7  
2)、在实验之前要进行哪些准备工作? Eq?o /'e  
首先要不加探针做常规的PCR实验,验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适,可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 1/n3qJyx2}  
3)、标本的采集和处理应该注意什么问题? ";~#epPkX  
根据实验要求和目的,有针对性采集病灶部位的标本;采集好的标本,最好根据每次实验用量,用冻存管分成几小份,放在-80℃保存,以免反复冻融;标本通常分成3类,如细胞组织、分泌物、血清全血;如果是血清,不能有融血现象的发生,否则会影响PCR的扩增;如果是全血,最好不用EDTA作为抗凝剂,选用柠檬酸作为抗凝剂,否则会影响PCR的扩增;如果是组织,最好用蛋白酶K消化;如果是提RNA的标本,更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 + $-a:zx`l  
4)、在做荧光定量实验时要注意些什么呢? @sDd:> t  
见产品操作注意事项。 @l?%]%v|  
5)、如果出现污染该怎么办? Y /+ D4^ L  
以替换法确定污染从何而来,对症下药,值得注意的是,因荧光定量PCR的敏感度极高,从防止污染的角度出发,最好在体系中加有dUTP,一旦出现污染现象,可以用UNG酶消除;同时将实验室分成4个区,即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。
快速回复
限200 字节
如果您在写长篇帖子又不马上发表,建议存为草稿
 
上一个 下一个