论坛风格切换切换到宽版
  • 2533阅读
  • 11回复

荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

上一主题 下一主题
离线sino

发帖
222
世科币
522
威望
267
贡献值
341
银元
0
只看该作者 10楼 发表于: 2012-10-30
M$|^?U>cm  
7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析; ` a  
目前市场上有许多种实时PCR仪:其中包括ABI7700,ABI7900,ABI7000 (Alied Biosystems);MX4000 (Stratagene);iCycler (Bio-Rad);Smartcycler(Cepheid);Robocycler (MJ Research);Lightcycler (Roche);ROTORGENE(CORBERT) ;杭州博日(Linegene)。 Z^s&]  
不同的仪器使用方法有所区别,但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG(hot start)和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 qm] k (/w  
为确保实验数据的有效性,每次实验都设阴性对照和4个标准品,每个样品都平行做2个复孔。 1VH7z  
基线或阀值的设定 通常是以10-15个循环的荧光值作为阀值,也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 v2/@Pu!kg  
{rf.sN~M  
8、疑难解答 l/#;GYB]  
R~PD[.\u  
可能原因
建议解决方法
+?DP r  
定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量
J7c( qGJI2  
DNA模板质量不好,含有抑制剂
M4~^tML>Ey  
提高模板质量,诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA
lhZXq!2p  
PCR引物设计较差
(_Ph{IN  
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
w&8N6gA 14  
探针设计较差
#Ie/|  
对探针序列进行blast比对,设计符合要求的探针
;&RBg+Pr  
PCR引物合成较差
(#KSwWo{ed  
用普通电泳法,看引物的设计和合成质量,是否有目的条带出现。
wIeF(}VM  
荧光探针无功能
t} 6QU  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 N(c`h  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 ^1`Mz<  
必要的话设计和合成探针。
e\)r"!?H`  
模板浓度太低
D`hl}  
使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
[Z]%jABR  
镁离子浓度太低
-8zdkm8k  
从3mM到5mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
/qaWUUf  
引物浓度太低
>p*7)  
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见公式1
{Qba`lOkq  
选择优质酶进行扩增
4 ++ &P9  
选择hot start Taq酶进行扩增,可提高灵敏度,增加产量,降低干扰因素
l~ Hu#+O  
退火温度太高
q:cCk#ra  
使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。
2`^M OGYk  
反应物中有不明物干扰
Ak kth*p  
在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰,对任何实验样品或试剂,均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
0e +Qn&$#4  
定量PCR阳性对照无扩增曲线(针对:已经优化好的体系)
~K@p`CRbV  
引物、探针设计合格;原来合成质量已经验证。需确认:
9fy[%M  
反应成分是否漏加;确定反应条件是否合适; K BlJJH`z{  
正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题; $sFqMy  
确认体系:1、引物是否降解(看扩增产物是否可电泳出)来判断引物和酶功能;2、探针是否降解(用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强)。
;TKsAU  
仪器是否正常工作
/b]+RXvxj  
kl|m @Nxp  
定量PCR阴性对照一直有扩增曲线
UNA!vzOb  
模板或PCR残余污染
<u  ImZC  
隔离污染来源,更换试剂。 [5PQrf~Mo  
使用UNG/dUTP防污染系统。 f3*S IKi  
使用专用的精致移液器。 &x3R+(H {  
在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。
]4Q~x  
体系有问题
?'si ^N  
酶浓度不对,Mg离子浓度不对
8#|PJc  
定量PCR(染料法)出现非特异信号
K7ZRj\(CJv  
引物二聚体多
`pXPF}T  
检查引物设计和合成环节,必要时更改引物
SpM Hq_MLM  
更换热启动酶
W"g@*B'|  
热启动酶能增加反应的特异性,提高灵敏度
rs@qC>_C0  
设定检测信号时的温度
2SYV2  
在更高的温度下检测荧光信号(此时引物二聚体已经解链)
qbo W<W<H1  
定量RT-PCR (y?`|=G-xT  
无扩增产量 << aAYkx <  
相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照
o vX9  
无cDNA合成
Es+BV+x[.c  
k5)e7Lb(  
cDNA合成温度太高
#zKF/H|_R  
降低保温温度
ipJnNy;  
反转录cDNA产物被二级结构封闭
t 5  
提高保温温度。重新设计引物
 JS!  
RNA被损害或降解
}&Jml%F4uR  
必要的话更换RNA
@d=4C{g%o  
RNAse污染
K~aI Y0=<  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
Kly`V]XE  
荧光探针无功能
X?Mc"M  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 1?bX$$y l;  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 ['rqz1DL5  
必要的话设计和合成探针。
= A;B-_c  
灵敏度低 TGe{NUO  
须在比预期更高的循环中检出产物(Ct滞后)
D#n^U `\if  
初始模板RNA不充分
DIu rFDQSS  
增加模板RNA的浓度;使用10ng-1µg的总RNA
-6KGQc}U  
RNA被损害和降解
|Skk1 #  
必要的话更换RNA
:}Tw+S5  
RNAse污染
o(I[_oUy\  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
=-c"~ 4  
无效的cDNA
K~_[[)14b  
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
rI5)w_E?  
无效的PCR扩增
O0{M3-  
注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 ~(xIG  
调整cDNA合成温度或引物设计
aD~3C/?aW  
检测使用仪器
tVZj tGz=  
扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查,是整体滞后还是个别孔滞后
PX3rHKK {  
PCR忠实性:PCR在产物序列中引入了错误
r[zxb0YA  
采用荧光探针法
 t]Xdzy  
增加结果特异性和产物的忠实性
;%Jw9G\h  
循环数太多
|2\6X's  
降低循环数。
}"<|.[V)  
四种dNTP的浓度不同
 E8WOXoP(  
制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。
@eN x:}  
离线sino

发帖
222
世科币
522
威望
267
贡献值
341
银元
0
只看该作者 11楼 发表于: 2012-10-30
其他问题: OH >#f6`[  
1)、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用? MD):g @  
?S<`*O +  
eF"k"Ckt'  
通常国外的文献可信度比较高,可直接使用;但为了保险起见,最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证;或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析,这样更有利于您对整个实验的把握。 <GWzdj?  
2)、在实验之前要进行哪些准备工作? Y'^+ KU  
首先要不加探针做常规的PCR实验,验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适,可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 L9$`zc  
3)、标本的采集和处理应该注意什么问题? MBqw{cy  
根据实验要求和目的,有针对性采集病灶部位的标本;采集好的标本,最好根据每次实验用量,用冻存管分成几小份,放在-80℃保存,以免反复冻融;标本通常分成3类,如细胞组织、分泌物、血清全血;如果是血清,不能有融血现象的发生,否则会影响PCR的扩增;如果是全血,最好不用EDTA作为抗凝剂,选用柠檬酸作为抗凝剂,否则会影响PCR的扩增;如果是组织,最好用蛋白酶K消化;如果是提RNA的标本,更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 hHk9O?  
4)、在做荧光定量实验时要注意些什么呢? vlqL  
见产品操作注意事项。 der\"?_.  
5)、如果出现污染该怎么办? l4> c  
以替换法确定污染从何而来,对症下药,值得注意的是,因荧光定量PCR的敏感度极高,从防止污染的角度出发,最好在体系中加有dUTP,一旦出现污染现象,可以用UNG酶消除;同时将实验室分成4个区,即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。
快速回复
限200 字节
如果您提交过一次失败了,可以用”恢复数据”来恢复帖子内容
 
上一个 下一个