荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析； Z, zWuE3  
目前市场上有许多种实时PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Alied Biosystems)；MX4000 (Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler (MJ Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。 e
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不同的仪器使用方法有所区别，但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 s[RAHU  
为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和4个标准品，每个样品都平行做2个复孔。 <prk8jSWV  
基线或阀值的设定 通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 !hA-_  
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8、疑难解答 euK5pA>L  
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问 题	可能原因	建议解决方法
S pIv#?   定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量	[7:,?$tC   DNA模板质量不好，含有抑制剂	H9Gh>u]}   提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA
H-!,yte   PCR引物设计较差	vJLK,[   避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
Ky`qskvu   探针设计较差	%6t :(z   对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针
\Zb;'eDv   PCR引物合成较差	3h]g}&k   用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。
.w:DFk^E]b   荧光探针无功能	&L3M]   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 U k lUw   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 6]i-E>p3R   必要的话设计和合成探针。
]43 /`FX   模板浓度太低	K&u_R   使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
n>z9K')   镁离子浓度太低	Fk 7?xc   从3mM到5mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
50h! X9   引物浓度太低	SZ7:u895E   最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1）
wKh4|Ka   选择优质酶进行扩增	.D~;u-%|F   选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素
B^=-Z8   退火温度太高	&$BjV{,/zc   使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
_oL?*ks   反应物中有不明物干扰	HdI8f!X'TG   在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰，对任何实验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
r+! YIk   定量PCR阳性对照无扩增曲线（针对：已经优化好的体系）	>~rTqtKd   引物、探针设计合格；原来合成质量已经验证。需确认：	;<Sd~M4f   反应成分是否漏加；确定反应条件是否合适； o#)C^xlQ   正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题； h8j .(   确认体系：1、引物是否降解（看扩增产物是否可电泳出）来判断引物和酶功能；2、探针是否降解（用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强）。
udH7}K v   仪器是否正常工作	E =67e=h
^0)g/`H^>   定量PCR阴性对照一直有扩增曲线	;C#F>SG\S   模板或PCR残余污染	P:S.~Jq   隔离污染来源，更换试剂。 ( Rh,,   使用UNG/dUTP防污染系统。 ,t744k')   使用专用的精致移液器。 e]aDP1n3t   在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
rKc9b<Ir   体系有问题	3%|&I:tI   酶浓度不对，Mg离子浓度不对
:kV#y   定量PCR（染料法）出现非特异信号	u Mv,zO5   引物二聚体多	7 z,C}-q   检查引物设计和合成环节，必要时更改引物
fbvL7* (   更换热启动酶	>6- `}G+|   热启动酶能增加反应的特异性，提高灵敏度
Vp\, CuQ   设定检测信号时的温度	E]d.z6k   在更高的温度下检测荧光信号（此时引物二聚体已经解链）
Nx;~@   定量RT-PCR 1I6px$^E\   无扩增产量 (9d&   相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照	|r/" |`   无cDNA合成	 3?yg\
=qIp2c}Rx   cDNA合成温度太高	3"e ,qY   降低保温温度
_VN?#J)o   反转录cDNA产物被二级结构封闭	"S]TP$O D   提高保温温度。重新设计引物
0OE:[pR   RNA被损害或降解	8<.Oq4ku   必要的话更换RNA
4VSU8tK|N]   RNAse污染	HV|,}Wks6s   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
da(<K}   荧光探针无功能	5;EvNu   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 ez$(c   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 |{ip T SH   必要的话设计和合成探针。
]=BB#   灵敏度低 @ 6vIap|   须在比预期更高的循环中检出产物（Ct滞后）	"y}5;9#,   初始模板RNA不充分	!a\^Sk /   增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA
ob]w;"   RNA被损害和降解	,P0) 6>   必要的话更换RNA
;uGv:$([g   RNAse污染	z1a7*)8P   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
fz_r7?   无效的cDNA	!4!~Lk=   通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
lB4WKn=?Kl   无效的PCR扩增	XjBD{m(   注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 eMzk3eOJ   调整cDNA合成温度或引物设计
rm_Nn8p,   检测使用仪器	,!9zrYi}   扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查，是整体滞后还是个别孔滞后
An@t?#4gxi   PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误	wIgS3K   采用荧光探针法	d(K+);!   增加结果特异性和产物的忠实性
~J]qP#C   循环数太多	d-%hjy3N   降低循环数。
.)3<Q}>   四种dNTP的浓度不同	Rb;'O89Hj@   制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。

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其他问题： Wqnc{oq|$  
1）、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？
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EnR}IY&sI  
通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。 }C:r9?T  
2）、在实验之前要进行哪些准备工作？ 7v kL1IA  
首先要不加探针做常规的PCR实验，验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适，可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 0f/<7R  
3）、标本的采集和处理应该注意什么问题？ hM{bavd  
根据实验要求和目的，有针对性采集病灶部位的标本；采集好的标本，最好根据每次实验用量，用冻存管分成几小份，放在－80℃保存，以免反复冻融；标本通常分成3类，如细胞组织、分泌物、血清全血；如果是血清，不能有融血现象的发生，否则会影响PCR的扩增；如果是全血，最好不用EDTA作为抗凝剂，选用柠檬酸作为抗凝剂，否则会影响PCR的扩增；如果是组织，最好用蛋白酶K消化；如果是提RNA的标本，更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 UZMd~|  
4）、在做荧光定量实验时要注意些什么呢？ bsX[UF
  
见产品操作注意事项。 L#J1b!D&<6  
5）、如果出现污染该怎么办？ (e~N q  
以替换法确定污染从何而来，对症下药，值得注意的是，因荧光定量PCR的敏感度极高，从防止污染的角度出发，最好在体系中加有dUTP，一旦出现污染现象，可以用UNG酶消除；同时将实验室分成4个区，即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。