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荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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离线sino

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只看该作者 10楼 发表于: 2012-10-30
m9i%U   
7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析; I z@x^s  
目前市场上有许多种实时PCR仪:其中包括ABI7700,ABI7900,ABI7000 (Alied Biosystems);MX4000 (Stratagene);iCycler (Bio-Rad);Smartcycler(Cepheid);Robocycler (MJ Research);Lightcycler (Roche);ROTORGENE(CORBERT) ;杭州博日(Linegene)。 `SbX`a0p2  
不同的仪器使用方法有所区别,但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG(hot start)和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 /]>{"sS(  
为确保实验数据的有效性,每次实验都设阴性对照和4个标准品,每个样品都平行做2个复孔。 &BR?;LD  
基线或阀值的设定 通常是以10-15个循环的荧光值作为阀值,也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 (G;*B<|A  
he6) L6T  
8、疑难解答 CK#PxT?"  
#&gy@!a~  
可能原因
建议解决方法
tr+~@]I+  
定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量
Fje%hcV  
DNA模板质量不好,含有抑制剂
|U0@(H  
提高模板质量,诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA
ShxX[k  
PCR引物设计较差
[ V~bo/n  
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
W1(zi P'6  
探针设计较差
aKO@_R,:  
对探针序列进行blast比对,设计符合要求的探针
GC2<K  
PCR引物合成较差
<hdCO< 0(  
用普通电泳法,看引物的设计和合成质量,是否有目的条带出现。
?HTwTi 5!)  
荧光探针无功能
. }wir,  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 n66 _#X  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 ai RNd~\  
必要的话设计和合成探针。
oxZ(qfjS  
模板浓度太低
4(]k=c1<  
使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
K"61i:F  
镁离子浓度太低
]M/w];:  
从3mM到5mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
 hT[O5  
引物浓度太低
-oj@ c OZ  
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见公式1
U\N`[k.F  
选择优质酶进行扩增
7@\iBmr6  
选择hot start Taq酶进行扩增,可提高灵敏度,增加产量,降低干扰因素
\)bwdNWI  
退火温度太高
LS`Gg7]S  
使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。
Lqt]  
反应物中有不明物干扰
+.=a R<Q  
在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰,对任何实验样品或试剂,均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
?Gb 18m  
定量PCR阳性对照无扩增曲线(针对:已经优化好的体系)
nxG vh4'i8  
引物、探针设计合格;原来合成质量已经验证。需确认:
/2c?+04+  
反应成分是否漏加;确定反应条件是否合适; `'~|DG}a  
正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题; {YkW5zC(L  
确认体系:1、引物是否降解(看扩增产物是否可电泳出)来判断引物和酶功能;2、探针是否降解(用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强)。
:)+cI?\#  
仪器是否正常工作
P ffRV7qU0  
18Ty )7r'  
定量PCR阴性对照一直有扩增曲线
46*?hA7@r(  
模板或PCR残余污染
2rA`y8g(L  
隔离污染来源,更换试剂。 3o6N&bQ b  
使用UNG/dUTP防污染系统。 k+&|*!j  
使用专用的精致移液器。 /7*u!CNm  
在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。
WO]dWO6Mm  
体系有问题
07CGHAxJ`  
酶浓度不对,Mg离子浓度不对
^G15]Pyw  
定量PCR(染料法)出现非特异信号
"",V\m  
引物二聚体多
I(pU_7mw  
检查引物设计和合成环节,必要时更改引物
%T!UEl`v  
更换热启动酶
H=EvT'g  
热启动酶能增加反应的特异性,提高灵敏度
M++*AZ  
设定检测信号时的温度
^KmyB6Yg  
在更高的温度下检测荧光信号(此时引物二聚体已经解链)
tPc'# .  
定量RT-PCR az\ ;D\\  
无扩增产量 WnU"&XZ  
相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照
H;%a1  
无cDNA合成
mbU[fHyV  
lhKd<Y"  
cDNA合成温度太高
{C[<7r uF  
降低保温温度
.^fq$7Y}7  
反转录cDNA产物被二级结构封闭
vH9/}w2  
提高保温温度。重新设计引物
_\1wLcFj  
RNA被损害或降解
=AUR]&_B  
必要的话更换RNA
  9Ld3  
RNAse污染
 ZOi8)Y ~  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
H*?U@>UU  
荧光探针无功能
kzMCI)>"  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 Y7zg  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 cO.U*UTmX  
必要的话设计和合成探针。
!vHnMY~AG  
灵敏度低 No=Ig-It  
须在比预期更高的循环中检出产物(Ct滞后)
nw+L _b  
初始模板RNA不充分
Z2_eT C u  
增加模板RNA的浓度;使用10ng-1µg的总RNA
q.yS j  
RNA被损害和降解
sU^2I v\%  
必要的话更换RNA
( \{9W  
RNAse污染
:DXk Ab2  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
*6s B$E_y  
无效的cDNA
'S@%  
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
BG_m}3j  
无效的PCR扩增
Q.7Rv XNw8  
注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 B$1nq#@  
调整cDNA合成温度或引物设计
zNofI$U  
检测使用仪器
W"?|OQ'  
扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查,是整体滞后还是个别孔滞后
r5%K2q{  
PCR忠实性:PCR在产物序列中引入了错误
;ob-'  
采用荧光探针法
 *>j u1f  
增加结果特异性和产物的忠实性
yx"xb Cc#  
循环数太多
-U)6o"O_CV  
降低循环数。
REDh`Wd  
四种dNTP的浓度不同
XmXp0b7  
制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。
8.HqQ:?&2t  
离线sino

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只看该作者 11楼 发表于: 2012-10-30
其他问题: 2J^jSgr50d  
1)、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用? x B%Felz  
W6b5elH@  
'+!@c&d#%o  
通常国外的文献可信度比较高,可直接使用;但为了保险起见,最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证;或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析,这样更有利于您对整个实验的把握。 qk Cj33v  
2)、在实验之前要进行哪些准备工作? w(sD}YA)  
首先要不加探针做常规的PCR实验,验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适,可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 $;9zD11  
3)、标本的采集和处理应该注意什么问题? 7 TTU&7l~  
根据实验要求和目的,有针对性采集病灶部位的标本;采集好的标本,最好根据每次实验用量,用冻存管分成几小份,放在-80℃保存,以免反复冻融;标本通常分成3类,如细胞组织、分泌物、血清全血;如果是血清,不能有融血现象的发生,否则会影响PCR的扩增;如果是全血,最好不用EDTA作为抗凝剂,选用柠檬酸作为抗凝剂,否则会影响PCR的扩增;如果是组织,最好用蛋白酶K消化;如果是提RNA的标本,更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 l9U^[;D  
4)、在做荧光定量实验时要注意些什么呢? l?+67cQLA  
见产品操作注意事项。 0;*1g47\  
5)、如果出现污染该怎么办? ebbC`eFD  
以替换法确定污染从何而来,对症下药,值得注意的是,因荧光定量PCR的敏感度极高,从防止污染的角度出发,最好在体系中加有dUTP,一旦出现污染现象,可以用UNG酶消除;同时将实验室分成4个区,即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。
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