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荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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离线sino

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只看该作者 10楼 发表于: 2012-10-30
BE2\?q-  
7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析; IwgA A)H  
目前市场上有许多种实时PCR仪:其中包括ABI7700,ABI7900,ABI7000 (Alied Biosystems);MX4000 (Stratagene);iCycler (Bio-Rad);Smartcycler(Cepheid);Robocycler (MJ Research);Lightcycler (Roche);ROTORGENE(CORBERT) ;杭州博日(Linegene)。 VY&9kN  
不同的仪器使用方法有所区别,但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG(hot start)和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 +zdq+<9X  
为确保实验数据的有效性,每次实验都设阴性对照和4个标准品,每个样品都平行做2个复孔。 X8l1 xD  
基线或阀值的设定 通常是以10-15个循环的荧光值作为阀值,也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 wgR@M[]o;  
gmAKW4(  
8、疑难解答 sImxa`kb  
e/% ;  
可能原因
建议解决方法
VX>t!JP p  
定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量
l<K.!z<-:8  
DNA模板质量不好,含有抑制剂
O7CYpn4<7  
提高模板质量,诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA
53&xTcv}x  
PCR引物设计较差
k#r7&Y  
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
uy- Ncy  
探针设计较差
i K[8At"Xo  
对探针序列进行blast比对,设计符合要求的探针
];}|h|q/{}  
PCR引物合成较差
1H[;7@o$e  
用普通电泳法,看引物的设计和合成质量,是否有目的条带出现。
5sCk y)N  
荧光探针无功能
hE#8_34%s  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 ds[Z=_Ll  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 HY|SLk/E  
必要的话设计和合成探针。
ZXDMbMD  
模板浓度太低
}N9a!,{P=b  
使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
^A<.s_  
镁离子浓度太低
;3}b&Z[N]  
从3mM到5mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
z'K7J'(R  
引物浓度太低
xENA:j?kF  
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见公式1
vlyNQ7"%  
选择优质酶进行扩增
'0M0F'R  
选择hot start Taq酶进行扩增,可提高灵敏度,增加产量,降低干扰因素
5e8-?w% e  
退火温度太高
a cZ|H  
使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。
H.~+{jTr  
反应物中有不明物干扰
Z:gsguX  
在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰,对任何实验样品或试剂,均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
;ypO'  
定量PCR阳性对照无扩增曲线(针对:已经优化好的体系)
|Qq'_4:  
引物、探针设计合格;原来合成质量已经验证。需确认:
FsZEB/c  
反应成分是否漏加;确定反应条件是否合适; }33Au-%*  
正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题; #^w 1!xXD  
确认体系:1、引物是否降解(看扩增产物是否可电泳出)来判断引物和酶功能;2、探针是否降解(用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强)。
1L9  <1  
仪器是否正常工作
#!j&L6  
X KeK;+  
定量PCR阴性对照一直有扩增曲线
mM~Q!`Nf.  
模板或PCR残余污染
IN*Z__l8j`  
隔离污染来源,更换试剂。 ~a)2 0  
使用UNG/dUTP防污染系统。 n9yv.p]  
使用专用的精致移液器。 [vJosbU;  
在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。
R dzIb-  
体系有问题
Fd0FG A&L  
酶浓度不对,Mg离子浓度不对
h 'CLf]  
定量PCR(染料法)出现非特异信号
"K]4j]yU  
引物二聚体多
y!Eh /KD  
检查引物设计和合成环节,必要时更改引物
L(YT6Vmm+t  
更换热启动酶
Jx,s.Z0@7,  
热启动酶能增加反应的特异性,提高灵敏度
!1]xKNp ]  
设定检测信号时的温度
";%1sK  
在更高的温度下检测荧光信号(此时引物二聚体已经解链)
{<Zqw]  
定量RT-PCR B W1O1zIh\  
无扩增产量 zoXF"Nz  
相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照
z(` kWF1<  
无cDNA合成
q9Wtu7/  
r4'Pf|`u  
cDNA合成温度太高
d DTt_B  
降低保温温度
|hAGgo/03  
反转录cDNA产物被二级结构封闭
{643Dz<e  
提高保温温度。重新设计引物
hy rJu{p  
RNA被损害或降解
GH!#"Sl8Z  
必要的话更换RNA
gqamGLK  
RNAse污染
l K%Hb=  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
NiF*h~ q  
荧光探针无功能
gfHlY Q]  
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 \(s ";@  
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 t `oP;  
必要的话设计和合成探针。
bzTM{<]sv  
灵敏度低 ?6gI8K6X  
须在比预期更高的循环中检出产物(Ct滞后)
*HUqW}_r  
初始模板RNA不充分
4D5)<3N=d'  
增加模板RNA的浓度;使用10ng-1µg的总RNA
7(- <x@e  
RNA被损害和降解
?uLqB@!2  
必要的话更换RNA
~drNlt9jf  
RNAse污染
" 7d_$.Z  
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
s5 BV8 M  
无效的cDNA
e~1??k.;=  
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
8^~]Ym:  
无效的PCR扩增
o<;"+@v  
注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。  }#1g;  
调整cDNA合成温度或引物设计
`O F\f   
检测使用仪器
=:lacK(0  
扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查,是整体滞后还是个别孔滞后
4 0eNgm^  
PCR忠实性:PCR在产物序列中引入了错误
.$rcTZ  
采用荧光探针法
xK f+.6 wz  
增加结果特异性和产物的忠实性
>8 c9-dTmf  
循环数太多
>dO^pDSs  
降低循环数。
V*)gJg  
四种dNTP的浓度不同
NB[b[1 Ch  
制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。
tO#y4<  
离线sino

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其他问题: s 1~&PH^  
1)、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用? xYSNop3 _  
<l>o6K  
GE?M. '!{{  
通常国外的文献可信度比较高,可直接使用;但为了保险起见,最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证;或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析,这样更有利于您对整个实验的把握。 <9Sg,ix't  
2)、在实验之前要进行哪些准备工作? A43 mX !g\  
首先要不加探针做常规的PCR实验,验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适,可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 ol#| .a2O  
3)、标本的采集和处理应该注意什么问题? K%i9S;~  
根据实验要求和目的,有针对性采集病灶部位的标本;采集好的标本,最好根据每次实验用量,用冻存管分成几小份,放在-80℃保存,以免反复冻融;标本通常分成3类,如细胞组织、分泌物、血清全血;如果是血清,不能有融血现象的发生,否则会影响PCR的扩增;如果是全血,最好不用EDTA作为抗凝剂,选用柠檬酸作为抗凝剂,否则会影响PCR的扩增;如果是组织,最好用蛋白酶K消化;如果是提RNA的标本,更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 2":{3=oW~  
4)、在做荧光定量实验时要注意些什么呢? N./l\NtZ  
见产品操作注意事项。 4 s&9A/&pC  
5)、如果出现污染该怎么办? U?/C>g%/PI  
以替换法确定污染从何而来,对症下药,值得注意的是,因荧光定量PCR的敏感度极高,从防止污染的角度出发,最好在体系中加有dUTP,一旦出现污染现象,可以用UNG酶消除;同时将实验室分成4个区,即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。
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