关于RNAi的研究 [复制链接]

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三，RNAi的应用前景 1A-EP@# J  
RNAi 技术中的相关问题主要涉及以下几点： /GGu` f  
(1) dsRNA 序列的选择dsRNA 主要选自已知的cDNA 的开放阅读框架(ORF) 中的基因区域。为防止mRNA 调控蛋白对RISC 与靶RNA 结合的干扰,应避免选择包括:1) 起始密码子下游或终止密码的50～100 核苷酸位置以内的区域;2) 5′或3′端的非翻译区域;3) 内含子区域。此外,序列选择时也应避开多聚鸟苷酸序列区( ≥3 个) ,因为这样容易形成四聚体结构, 抑制RNAi 作用。选择与靶mRNA 上序列互补的21～23 个核苷酸长度的片段,以AA 开头为佳,因为此法能简化dsRNA 合成过程,降低成本,而且合成的dsRNA 能更好地抵抗RNA 酶的降解。另外,尽量使dsRNA 序列中的GC含量接近50 %(45 %～55 %最佳) ,高GC 含量能明显降低基因沉默的效应。选择前可以搜索BLAST数据库,保证无其他与靶基因同源的基因存在,避免引起对其他相似基因的沉默作用。并不是所有的mRNA 均对RNAi 敏感。为确保靶基因表达的有效抑制,最好同时合成两个或以上的针对同一基因的不同靶区域的dsRNA ;而且,标记dsRNA 正义链的3′端对RNAi 现象并没有影响,现有的实验尚未发现mRNA 的二级结构对RNAi 有任何显著的影响。目前,RNAi 技术主要以哺乳动物细胞为对象研究其基因的功能。但> 30 的dsRNA 在哺乳动物细胞中会引起干扰素样效应,导致非特异性反应。因而直接选用其下游的产物分子siRNA 来代替,达到基因研究的目的。 (=V[tI+Ngt  
(2) dsRNA 的导入方法不同的生物体可以选择不同的方法。简单生物,如单细胞生物等,可选用电穿孔的方法; 较复杂生物可选用dsRNA 微注射入生殖细胞或早期胚胎,线虫也能采用肠道或假体腔注射的方法,与微注射相比,RNAi 效率上并无显著差别。还有浸泡法、工程菌喂养法、磷酸钙共沉淀法等。若使用的是化学法人工合成的siRNA(正义链和反义链) ,还要经过退火过程,以双链的形式导入靶细胞。有人提出了以质粒或病毒为载体,通过转导或转染途径,在细胞内以DNA 为模板,利用RNA 聚合酶Ⅲ,转录为siRNA(直接形成双链或通过回文序列折叠后形成发夹结构) ,也能产生较明显的RNAi 效应。最近,又有一种新的导入方法,就是借助高压水枪的外力将构建的质粒直接自小鼠的尾静脉注入体内,观察RNAi 在活体生物模型而不是培养细胞上的基因沉默效应 ,但观察到的siRNA 的半衰期较短,而且由于使用了高压的外力,过程较复杂,限制了其在人类疾病治疗方面的应用。而Pachuk 等则提出了肌注的方法,将针对IL－12 的siRNA 的质粒表达载体导入小鼠体内,得到的RNAi 效应更持久。 l&xD3u^G  
(3) 发夹样结构的siRNA实验证明,发夹样siRNA 能延长在细胞内的作用时间。此类结构可由具有回文序列的核苷酸链形成。但通常回文结构不易获得,也可用头碰头的对称序列来代替。转录发夹样siRNA 的模板必须与载体转录启动子紧密相连,而且尽可能有最短的多聚腺苷酸尾巴,这样才能诱导高效的RNAi 效应。Paddison 等提出类似的结构也可应用于长片段dsRNA (500 左右) ,而不会引起RNA 非特异性的降解。这为检测哺乳动物细胞中经过长期发育后的基因功能提供了新的途径。 `wd*&vl  
RNAi 的应用领域及前景：RNAi 是一种高效的特异性强的基因阻断技术,近年来发展迅速,很快就成为功能基因组研究的有力工具。通过实验手段将dsRNA 分子导入细胞内, 特异性地降解细胞内与其序列同源的mRNA ,封闭内源性基因表达,从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。早期就有人应用此项技术分离了果蝇胰岛素信号转导途径通路中的各种成分。近来也有实验报道通过RNAi 研究细胞内脂质平衡过程中涉及的各条途径。在这之前,曾利用反义RNA 与靶mRNA 序列互补的特性来抑制其表型的发生,但由于反义RNA对内源性表达的基因抑制作用较弱,往往会产生一些过渡表型,易造成对基因功能判断错误,目前已通过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物———Vitravene 。RNAi 技术与之相比,特异性更高,作用更迅速,副反应小,在有效地沉默靶基因的同时,对细胞本身的调控系统也没有影响。最近在人类体细胞里已经成功地对近20 种基因功能进行了“敲除”,尤其是因此而了解了人类空泡蛋白Tsg101 对HIV 在人体内增殖的作用,进一步深化了对HIV 的研究。Leonid 等以脊髓灰质炎病毒为模型,利用RNAi 来诱导细胞的胞内免疫,产生抗病毒效应,尤其是针对RNA 病毒。对于易突变的病毒,可设计多种靶向病毒基因保守序列的dsRNA ,减少它对dsRNA 的抵抗。Maen 等也应用RNAi 技术成功地阻断了MCF－7 乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因21 的功能。RNAi 技术的应用,不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学) 的发展,还有可能设计出RNAi 芯片,高通量地筛选药物靶基因,逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能,并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域,用RNAi 技术来抑制基因的异常表达,为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。